張宏瑞 ，鄭永杰 ，田景芝

（1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市質(zhì)量檢測(cè)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O是芳香胺類(lèi)工業(yè)染料，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色[1]。由于堿性橙比檸檬黃和日落黃等水溶性染料更易于在豆腐、糕點(diǎn)、鮮海魚(yú)上著色且不易褪色，因此，一些不法商販用堿性橙Ⅱ?qū)@類(lèi)食品進(jìn)行染色[2，3]。有報(bào)道指出，過(guò)量吸入、攝取或皮膚接觸堿性橙Ⅱ可造成急性和慢性的中毒，而且相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明堿性橙為致癌物[4-6]。中華人民共和國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB2760）規(guī)定,堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O禁止用作食品添加劑[7，8]。

目前，沒(méi)有堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O檢測(cè)方法的國(guó)標(biāo)。其檢測(cè)最常采用的分析方法是高效液相色譜法[1，6，9]。許多文獻(xiàn)報(bào)道了使用高效液相色譜（HPLC）對(duì)豆制品、辣椒粉及黃魚(yú)中的堿性橙Ⅱ的分析方法[4，5，10]，但是對(duì)蛋糕中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃 O 進(jìn)行檢測(cè)的方法較少。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)HPLC檢測(cè)蛋糕中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)乙腈提取、正己烷脫脂、乙醚萃取的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，確定了HPLC檢測(cè)蛋糕中堿性橙含量的較佳的前處理方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司的堿性橙標(biāo)樣，其中包括堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O。

甲醇（色譜純）；正己烷、乙酸銨、H3PO4、Na2SO4、乙腈、NH3·H2O、NaCl、乙醚（分析純）等。

Ag ilent高效液相色譜儀；二極管陣列檢測(cè)器；氮吹儀；旋渦振蕩器；離心機(jī)；超聲清洗器等。

1.2 樣品前處理方法

方法一：有機(jī)溶劑萃取

稱(chēng)取10.0g蛋糕樣品，每10.0g樣品中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)量分別10.0mg和15.0mg，粉碎后放入125mL具塞錐形瓶中，加入乙腈和4g無(wú)水硫酸鈉后搖勻，并對(duì)其進(jìn)行超聲提取。將上清液離心（3500r·min-1，15min）。取 5.0mL提取液于 20mL試管中,用3mL正己烷渦旋萃取4次，棄去正己烷層，將其放入40℃水浴中，用氮?dú)獯抵两伞＜尤?mL 2%的氨水和0.5g氯化鈉，用無(wú)水乙醚萃取3次，收集乙醚提取液，用氮?dú)獯蹈?用流動(dòng)相溶解后定容到2.0mL。用0.22μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

方法二：使用固相萃取柱萃取

稱(chēng)取8～10g均質(zhì)后樣品,每10.0g樣品中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)量分別10.0mg和15.0mg。加入15mL甲醇，搖勻后超聲提取30min。以8000r·min-1離心10min，收集上層清液。用少量甲醇提取殘?jiān)?次。合并提取液，在氮吹儀上吹干，加入1mL正己烷溶解。中性氧化鋁SPE小柱分別用2mL甲醇和正己烷預(yù)洗后上樣，使用20mL正己烷淋洗，使洗脫液變?yōu)闊o(wú)色，用2mL 80%的甲醇淋脫，收集淋洗液，定容至5mL，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 色譜分析條件

色譜柱為 XDB-C18（5μm，4.6mm×150mm）；柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為452nm，對(duì)比波長(zhǎng)為650nm；進(jìn)樣量為 20μL；流速：1.0mL·min-1。流動(dòng)相為甲醇和0.02mol·L-1乙酸胺溶液。梯度洗脫條件：0～10min甲醇與乙酸胺溶液比例由（50∶50）洗脫到（80∶20）；10～15min 甲醇與乙酸胺溶液比例為（80∶20）；15～18min 甲醇與乙酸胺溶液比例由（80∶20）洗脫到（50∶50）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel（2003）初步整理后，采用SPSS（11.5）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理中乙腈的使用量對(duì)樣品測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響

圖1是標(biāo)樣以及加標(biāo)樣品的色譜圖。

圖1 （1）標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖；（2）加標(biāo)后樣品的譜圖Fig.1 （1）Chromatogram of standard sample（2）Chromatogram of sample added sample

表1是方法一中乙腈使用量對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O加標(biāo)回收率的影響，超聲時(shí)間為40min，乙醚使用量為每次3mL。

表1 乙腈使用量對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率（%）的影響Tab.1 Effect of volume of acetonitrile on the recovery rate of chrysoidin and auramine O

由表1可以看出，乙腈使用量為40mL時(shí)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率最高，乙腈使用量小于30mL時(shí)，其加標(biāo)回收率隨著乙腈使用量的增加而顯著增加。有報(bào)道指出乙腈具有很好的滲透性,對(duì)樣品中的色素提取完全且所含的干擾雜質(zhì)較少[8]。其他前處理?xiàng)l件不變，使用35mL乙醇代替乙腈時(shí)，堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率分別為68.42%和71.53%，顯著低于使用乙腈時(shí)的加標(biāo)回收率，88.61%和87.01%。所以，乙腈更適合用于對(duì)堿性橙的提取。

2.2 前處理中超聲時(shí)間對(duì)樣品測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響

表2是方法一中超聲時(shí)間對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O加標(biāo)回收率的影響，其中超聲時(shí)間如表所示，乙腈使用量為35mL，乙醚使用量為每次3mL。

表2 超聲時(shí)間對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率（%）的影響Tab.2 Effectof the time of ultrasonic on the recovery rate of chrysoidin and auramine O

由表2可以看出，超聲時(shí)間小于50min時(shí)，堿性橙加標(biāo)回收率隨著超聲時(shí)間的增加而顯著增加；超聲時(shí)間小于30min時(shí)堿性嫩黃O加標(biāo)回收率隨著超聲時(shí)間的增加而顯著增加。其中超聲時(shí)間為50min時(shí)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率最高。

2.3 前處理中乙醚使用量對(duì)樣品測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響

方法一中使用正已烷脫脂后，使用乙醚對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行3次萃取。表3是乙醚使用量對(duì)其加標(biāo)回收率的影響，其中乙醚的使用量如表所示，乙腈使用量為每次35mL，超聲時(shí)間為40min。

表3 乙醚使用量對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率（%）的影響Tab.3 Effectof volume of aether on the recovery rate of chrysoidin and auramine O

由表3可以看出，乙醚使用量為3.0mL時(shí)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率最高。有報(bào)道指出乙醚對(duì)堿性橙的溶解力較強(qiáng)，所以乙醚的使用量對(duì)加標(biāo)回收率的影響不大[8，10]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

2.4 兩種前處理方法對(duì)比

方法一是使用有機(jī)溶劑對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行萃取，方法二是使用固相萃取柱對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行萃取。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)兩種前處理方法進(jìn)行比較，其中方法一中的乙腈使用量為每次35mL，超聲時(shí)間為40min，乙醚使用量為每次3mL。結(jié)果表明，使用有機(jī)溶劑萃取法后的堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O加標(biāo)回收率分別為88.61±0.64%和87.01±1.54%。使用固相萃取法后其加標(biāo)回收率分別為81.20±0.82%和 80.01±1.73%（P＜0.05），這兩種前處理方法對(duì)加標(biāo)回收率影響的差異不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

對(duì)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，使用有機(jī)溶劑提取法和固相萃取法做液相前處理時(shí)，堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率都比較高，由于固相萃取柱的價(jià)格比較昂貴，因此，前處理時(shí)可以使用有機(jī)溶劑提取法代替固相萃取法。使用有機(jī)溶劑提取法的最佳條件為乙腈使用量為每次35mL，超聲時(shí)間為40min，乙醚使用量為3.0mL。堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率達(dá)到88.61%和87.01%。

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