何 瑞，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學信息學院，山西太谷 030801）

玉米是我國的重要糧食作物，栽培面積僅次于小麥、水稻，居第3位。玉米產(chǎn)量的高低受多種因素影響，包括雜交種的增產(chǎn)潛力、氣候條件、栽培措施、水肥管理、病蟲害的發(fā)生等。玉米苗枯病是世界上廣泛發(fā)生、為害嚴重的玉米病害之一。近幾年，由于大量種植感病品種、種子帶菌和生長前期不良氣候以及粗放的栽培管理等原因，造成該病害呈現(xiàn)出發(fā)病范圍廣、發(fā)病面積大、為害程度重的趨勢，嚴重影響著我國玉米的產(chǎn)量，已成為我國玉米生產(chǎn)上亟待解決的問題[1]。其在我國發(fā)生時間較短，20世紀90年代初只在部分玉米產(chǎn)區(qū)點片發(fā)生，但由于種子帶菌，玉米苗枯病在我國發(fā)生的面積逐年擴大，很快波及到我國主要的玉米產(chǎn)區(qū)。玉米苗枯病的發(fā)生受多種因素影響，種子帶菌是苗枯病發(fā)生的前提，土壤通氣性差、濕度過大、土壤中鉀素的缺乏等有助于苗枯病的發(fā)生[2-4]。致病菌有串珠鐮刀菌、串珠鐮刀菌膠孢變種、禾谷鐮刀菌、炭黑蠕孢菌、立枯絲核菌等8種，還有地方報道為串珠鐮刀菌（F.moniliforme）與禾谷鐮刀菌（F.graminearum）共同侵染，其中，串珠鐮刀菌是玉米苗枯病的主要病原菌，該致病菌為弱寄生菌，在土壤中一般可存活2～3 a。

本研究通過對致病菌分離、鑒定并利用PCR技術(shù)對其DNA進行擴增和序列分析，進一步確定該地區(qū)苗枯病的致病菌種類及其分類地位，且對玉米苗枯病的發(fā)病規(guī)律及其癥狀進行了研究，以期為該病的防治和抗病育種工作提供依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 玉米苗枯病病株采自山西省昔陽縣。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑包括PSA培養(yǎng)基、大米飯、Bilai，s培養(yǎng)基、DNA抽提液、PCR 擴增藥品；儀器包括試管、培養(yǎng)皿、解剖鏡、顯微鏡、離心機、PCR儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米苗枯病病原菌的分離、純化、培養(yǎng)及保存 以常規(guī)組織分離法對采集的玉米苗枯病病標樣進行病原物分離。葉片組織經(jīng)消毒后，在病斑區(qū)域切取小塊，置PSA平板上于25℃下黑暗培養(yǎng)。待菌落形成后，進行鏡檢，挑取單孢于PSA平板上純化培養(yǎng)。切取純化后培養(yǎng)物菌落邊緣的菌絲置于PSA斜面培養(yǎng)，待充分生長后，保存于4℃冰箱里。使用時挑取少量的菌種轉(zhuǎn)入PSA平板上，25℃下培養(yǎng)備用。

1.2.2 致病性測定的接種及調(diào)查方法 分離物在PSA平板上培養(yǎng)。待菌落長滿PSA平板后，用蒸餾水洗下分生孢子，配置成濃度1×106個/mL分生孢子的孢子懸浮液，再加上少許吐溫搖勻，接種5個玉米健株。在植株長到6～7葉期進行接種，接種后保濕24 h，濕度大于90%，溫度保持在25～30℃之間。10 d后調(diào)查玉米植株的發(fā)病情況，并從發(fā)病的植株上再分離病原[6]。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學特性測定 挑取少量純化的菌絲于PSA上培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)、顏色等培養(yǎng)特性，挑取分生孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。在解剖鏡和顯微鏡下觀察病原菌在玉米莖稈上形成的孢子形態(tài)，使用DFC320數(shù)碼攝像頭配合Qwin V3軟件記錄其形態(tài)并測量大小。詳細忘錄PSA平板上的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢情況[7-8]。

1.2.4 病原菌rDNA-ITS的擴增與序列分析

1.2.4.1 病原菌總DNA的提取 菌絲培養(yǎng)用查氏培養(yǎng)液在振蕩培養(yǎng)箱中27℃培養(yǎng)7 d，經(jīng)過濾收集菌絲，提取方法參照SDS法[8]。

1.2.4.2 rDNA-ITS擴增與序列測定 采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4（5'-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3'），和ITS5（5'-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3'）擴增該病原菌的ITS區(qū)，預(yù)計擴增片段為600bp。PCR擴增體系（50μL）為：DNA模板 1.0μL，引物 1（10μmol/L）1.0μL，引物 2（10 μmol/L）1.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，5 U Taq 酶 0.3 μL，用ddH2O使終體積達到50 μL。擴增程序：94℃預(yù)變性7 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。反應(yīng)終止后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。委托北京天根生物工程有限公司進行純化和序列測定。

1.2.4.3 病原菌ITS序列同源性比較 測序后的序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進行同源序列搜索，比較測試菌株同現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的相似程度。在GenBank上選取同屬的代表性菌株，并以Gaeum annom yces gram in is

[9]作為序列分析的外群[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米苗枯病的危害與癥狀特點

近幾年，制種玉米苗枯病發(fā)生嚴重，并有發(fā)展趨勢，重病田發(fā)病率高達30%以上，甚至有的田塊嚴重缺苗，翻犁改種，已成為影響制種玉米高產(chǎn)、農(nóng)民增收的重要問題。玉米苗枯病主要發(fā)生在5月中下旬（玉米4～7葉期），癥狀表現(xiàn)為葉片邊緣首先出現(xiàn)黃褐色枯死條斑，個別葉片或植株出現(xiàn)萎蔫，3～5 d后葉片變青灰色或黃褐色枯死。發(fā)病株根毛初期出現(xiàn)淡黃色至黃褐色侵染點，1～2 d后即變?yōu)辄S褐色水漬狀壞死，嚴重時皮層腐爛，根毛脫落（圖1）。拔起病株，發(fā)現(xiàn)在根部發(fā)病部位有時出現(xiàn)白色、灰白色或粉紅色霉狀物，即病原菌分生孢子梗和分生孢子（圖2）。

2.2 苗枯病病原菌的形態(tài)鑒定

2.2.1 培養(yǎng)性狀

從圖3可以看出，（1）生長速度：在PSA培養(yǎng)基上25℃，4 d的菌落直徑為4.6～4.7 cm。（2）PSA培養(yǎng)基上：氣生菌絲棉絮狀，白色至淡牽牛紫?；锉砻娴?，基物不變色。（3）米飯上：氣生菌絲為白色至粉色。（4）Bilai，s培養(yǎng)基上：氣生菌 絲粉狀，白色。

2.2.2 形態(tài)特征 （1）小型分生孢子（圖4）：數(shù)量多、橢圓形、瓜子形，串狀著生，無隔。量度：（15.4～35.5）μm×（6.2～8.8）μm。（2）大型分生孢子（圖5）：PSA培養(yǎng)基上未見。在米飯培養(yǎng)基上，孢子鐮刀形，細長，中間較直，兩端稍彎曲，向兩端變化均勻，頂胞漸尖，基孢足跟不明顯，隔膜易消解，2～4分隔，多為3分隔。量度：（44.9～64.6）μm×（7.0～9.0）μm。（3）產(chǎn)孢細胞類型：單瓶梗，產(chǎn)孢梗短。（4）厚垣孢子：無。

對病原菌分生孢子的分隔和量度進行了抽樣測量，結(jié)果（表1）顯示，20個病害標樣的10個病原菌株的鑒定均獲得基本一致的結(jié)果，表明山西省昔陽縣玉米苗枯病病菌的組成比較單一，根據(jù)病原菌形態(tài)特征的描述，初步鑒定該病原菌可能是串珠鐮刀菌（F.moniliforme）。

表1 分離菌株分生孢子的分隔和量度

2.3 病原菌致病性測定

將純化后的菌株重新接種到健康的玉米葉片上，回接7～9 d，接種菌絲塊、孢子懸浮液的玉米葉片全部發(fā)病，有傷口的葉片發(fā)病比無傷口的葉片早1～2 d，癥狀與田間觀察相同，對照不發(fā)??；用發(fā)病的病斑進行常規(guī)分離，再次獲得與原來分離菌基本一樣的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為玉米苗枯病的病原菌。

2.4 病原菌的序列分析及同源性

引起玉米苗枯病的病菌主要有串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌，為進一步確定山西昔陽縣的玉米苗枯病是否為串珠鐮刀菌，本研究分析了該菌的ITS區(qū)序列。菌株的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1個600 bp左右的片段（圖6），經(jīng)序列測定，確定該片段長度為592 bp（圖7），與預(yù)期結(jié)果一致。將測得的序列在GenBank中進行同源序列搜索（BLAST搜索），結(jié)果表明，所測得的序列與串珠鐮刀菌（F.moniliforme）同源性為100%，進一步證明引起山西省昔陽縣玉米苗枯病的病原菌為串珠鐮刀菌。

圖7 串珠鐮刀菌（F.moniliforme）ITS區(qū)序列片段

3 討論

本研究將引起山西昔陽縣的玉米苗枯病的病原菌鑒定為串珠鐮刀菌（F.moniliforme），有的地方報道的苗枯病病原菌為禾谷鐮刀菌（F.graminearum），致病菌有串珠鐮刀菌、串珠鐮刀菌膠孢變種、禾谷鐮刀菌、炭黑蠕孢菌、立枯絲核菌及腐霉菌等8種，還有的地方報道為串珠鐮刀菌（F.moniliforme）與禾谷鐮刀菌（F.graminearum）共同侵染[11]。本研究表明，不同地區(qū)引起玉米苗枯病的病原菌的確存在不同，所以，明確各地的病原種類，對進一步研究該病的發(fā)生與流行，以及通過品種改良來提高品種抗病性均具有重要意義。本研究結(jié)果還表明，山西昔陽縣發(fā)生的玉米苗枯病的病原菌在傳統(tǒng)生物學特性及致病性上無明顯差異，病原菌結(jié)構(gòu)比較單一，這對于病害的防治與抗性的選育是十分有利的。

串珠鐮刀菌（F.moniliforme）種級鑒定標準是以分生孢子的大孢子和小孢子形態(tài)為主、培養(yǎng)特征為輔和寄主范圍作參考的綜合特征來確定的，但鐮刀菌中許多種的分生孢子都較相似，對于非專業(yè)分類研究來說，單從分生孢子形態(tài)學的特征上較難鑒定苗枯病。此外，一些學者認為，僅根據(jù)形態(tài)學特征來進行苗枯病的鑒定與分類通常是不適當?shù)?。rDNAITS是介于18 SrDNA，5.8 S rDNA和28 S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快，可以提供足夠多的變異來進行種間和種內(nèi)的分子系統(tǒng)研究[10]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，rDNA-ITS序列分析已被廣泛應(yīng)用于各種病原真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究中。

本研究以傳統(tǒng)的形態(tài)學特征為基礎(chǔ)，并對山西昔陽縣玉米苗枯病病原菌的rDNA-ITS序列進行分析和比較，從分子生物學水平上進一步鑒定引起山西昔陽縣玉米苗枯病的病原菌為串珠鐮刀菌，為進行該病害的防治和抗性品種選育研究提供了一定的理論依據(jù)。

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