孫 錄，史 磊，呂 薇，耿 虹，王 華

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130041；3.吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

HPLC法測(cè)定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿含量方法的建立及評(píng)價(jià)

孫 錄1，史 磊2，呂 薇1，耿 虹3，王 華1

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130041；3.吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

目的：建立高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿含量的新方法，優(yōu)化清熱通淋片質(zhì)量的檢測(cè)和控制。方法：采用HPLC法。以苦參堿、氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，清熱通淋片為樣品。使用Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱Genimi－C18（5μm，4.6mm×250mm），流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH＝3.0）－甲醇（93∶7），流速為0.8mL·min－1，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，進(jìn)樣量為10μL。通過(guò)對(duì)HPLC法進(jìn)行線性關(guān)系、專屬性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度試驗(yàn)以進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果：苦參堿回歸方程為Y＝1 102.1X＋15.423，其進(jìn)樣量在0.311 8～4.677 0μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r＝0.999 9），平均加樣回收率為97.1%，RSD＝0.24%（n＝6）；氧化苦參堿回歸方程為 Y＝1 106.6X＋5.040 2，其進(jìn)樣量在0.029 8～0.446 4μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r＝0.999 6），平均加樣回收率為98.4%，RSD＝1.52% （n＝6）。在穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，苦參堿和氧化苦參堿的RSD值分別為1.21%、1.47% ；0.13%、2.76%；0.48%（苦參堿和氧化苦參堿之和的RSD）。結(jié)論：HPLC方法分離效果好、專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、靈敏和準(zhǔn)確，可作為清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿含量的測(cè)定方法。

高效液相色譜法；清熱通淋片；苦參堿；氧化苦參堿

清熱通淋片 （Qingre Tonglin Tablet，QRTLT）是由爵床、白茅根、苦參、硼砂等4味藥材組成，具有清熱、利濕、通淋的功效?？鄥橹魉?，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)消炎利尿的功效［1］。苦參中含有苦參堿和氧化苦參堿等生物堿［2－3］，在心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤等方面有重要的藥理活性［4］。原標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［5］只測(cè)定苦參堿的含量，未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿控制QRTLT質(zhì)量的報(bào)道，QRTLT在制備過(guò)程中，由于苦參粉末和煎煮入藥的工藝不同，苦參堿和氧化苦參堿的含量也有變化，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)QRTLT制法及工藝特點(diǎn)，參考相關(guān)文獻(xiàn)［6－9］采用高效液相色譜（HPLC）法建立了氧化苦參堿的含量測(cè)定方法，改進(jìn)了苦參堿的含量測(cè)定方法，并將原標(biāo)準(zhǔn)中僅測(cè)定苦參堿修訂為測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿的總和計(jì)算含量，使樣品的含量測(cè)定更為合理。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；MILL－Q純水處理器 、CQX－12型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。苦參堿對(duì)照品（批號(hào)為110805－200306）和氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)為110780－200506）均為中國(guó)藥品生物質(zhì)品檢定所提供，供含量測(cè)定用；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純；QRTLT（批號(hào)為2010101，2010102，20100501）為江西杏林白馬藥業(yè)有限公司提供。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Genimi－C18 （5 μm，4.6mm ×250mm ），以 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （pH 3.0）－甲 醇（93∶7）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，流速0.8mL·min－1，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦參堿對(duì)照品15mg、氧化苦參堿對(duì)照品8mg，分別置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再各精密量取5mL，分別置于25mL量瓶中，用磷酸緩沖液（pH 3.0）稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備 取 QRTLT粉末1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷50mL，濃氨試液1mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過(guò)夜，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30min，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足其減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25mL，回收溶劑至干，立即取下，殘?jiān)蛹状?mL使其溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 陰性樣品對(duì)照液的制備 按處方比例，取除苦參外的其余藥味，按工藝要求制成不含苦參的陰性樣品，再按1.3.2中的方法制成陰性樣品對(duì)照液。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品對(duì)照液各10μL，分別注入液相色譜儀測(cè)定，分別測(cè)得色譜圖（圖1），結(jié)果供試品色譜中，在與苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的色譜峰，而陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明陰性樣品無(wú)干擾。

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 苦參堿 精密稱取苦參堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1mL含0.311 8mg的溶液，分別精密吸取1、3、5、10和15μL測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)苦參堿濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1 102.1X＋15.423（r＝0.999 9，n＝6），結(jié)果表明：苦參堿進(jìn)樣量在0.311 8～4.677 0μg范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系，符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 氧化苦參堿 精密稱取氧化苦參堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1mL含0.029 76mg的溶液，分別精密吸取1、3、5、10和15μL測(cè)定，以峰面積 （Y）對(duì)苦參堿濃度 （X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1 106.6X＋5.040 2（r＝0.999 6，n＝6），結(jié)果表明：苦參堿進(jìn)樣量在0.029 8～0.446 4μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10μL，在0、2、4、6、9及12h測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿峰面積值，結(jié)果苦參堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差 （relative standard deviation，RSD）為1.21%，氧化苦參堿RSD＝1.47% （n＝6），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10μL，按上述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果其中苦參堿RSD為0.13%，氧化苦參堿 RSD為2.76% （n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.3.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別取10μL進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果氧化苦參堿和苦參堿之和的平均含量為1.1mg／片 （RSD ＝0.48%，n＝6），表明本法的重復(fù)性良好。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.6.1 苦參堿 取QRTLT （苦參堿的含量為2.681mg·g－1）0.5g共6份，精密稱定，置于已經(jīng)分別精密加入對(duì)照品溶液 （0.311 8g·L－1）2.1mL （揮干溶劑）的具塞錐形瓶中，按1.3.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，符合定量分析的要求。見(jiàn)表1。

表1 苦參堿回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery rate test of matrine （n＝6）

2.6.2 氧化苦參堿 取QRTLT （氧化苦參堿的含量為0.261mg·g－1）0.5g共6份，精密稱定，置已分別精密加入對(duì)照品溶液 （0.029 76g·L－1）2.5mL （揮干溶劑）的具塞錐形瓶中，按1.3.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，符合定量分析的要求。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 樣品測(cè)定

按上述色譜條件和含量測(cè)定方法，精密測(cè)定3批樣品，記錄峰面積，計(jì)算每片含量。見(jiàn)表3。

表2 氧化苦參堿回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery rate test of oxymatrine （n＝6）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of samples（m／mg）

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液分別測(cè)定其紫外吸收光譜，根據(jù)其最大吸收波長(zhǎng)，同時(shí)參考文獻(xiàn)［10－12］，并考慮測(cè)定時(shí)樣品的穩(wěn)定性，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。在選定條件下，苦參堿與氧化苦參堿和樣品中其他組分色譜峰可基線分離。

3.2 流動(dòng)相的選擇

①乙腈－0.1%磷酸二氫鉀溶液 （每1 000mL含磷酸1.6mL，三乙胺0.4mL） （3∶97） （原QRTLT含量測(cè)定用流動(dòng)相）；②乙腈－水 （6.80g的磷酸二氫鉀＋1.01g的庚烷磺酸鈉→1 000mL水中，三乙胺pH值調(diào)至7.0） （18∶82） （原QRTL膠囊含量測(cè)定用流動(dòng)相）；③磷酸鹽緩沖液（pH3.0）－甲醇 （93∶7）為流動(dòng)相。磷酸鹽緩沖液制法：取3.402g磷酸二氫鉀溶解于1L超純水中，用磷酸調(diào)pH至3.0。結(jié)果表明：使用流動(dòng)相③平衡時(shí)間最短，分離效果最好；使用流動(dòng)相①、②也可使供試品溶液較好分離，但三乙胺對(duì)色譜柱損害較大，會(huì)降低色譜柱的使用壽命。

3.3 供試品提取純化條件的選擇

根據(jù)苦參堿和氧化苦參堿的溶解性能，并參考有關(guān)文獻(xiàn)［13－14］采用了4種方法進(jìn)行提取純化。最終選取如下方法：取本品粉末1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷50mL，濃氨試液1mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過(guò)夜，再進(jìn)行超聲處理。因?yàn)榉胖眠^(guò)夜后制備的供試品含量高于未放置過(guò)夜、直接超聲或回流提取的供試品，而且超聲的方法比回流法更為簡(jiǎn)便，故采取 “放置過(guò)夜、再超聲處理”的供試品溶液的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)QRTLT制法及工藝特點(diǎn) （苦參三分之二粉碎，三分之一水煎煮入藥，粉末中含氧化苦參堿的較多），改進(jìn)了含量測(cè)定方法，并將原標(biāo)準(zhǔn)中僅以苦參堿計(jì)算含量，修訂為以苦參堿和氧化苦參堿的總和計(jì)算，使樣品的含量測(cè)定更為合理。根據(jù)QRTLT制法、工藝、處方量及制成量，暫定為本品每片含苦參堿和氧化苦參堿的總量不得少于1.0mg。本方法可以較好地實(shí)現(xiàn)QRTLT的質(zhì)量控制。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典 （上冊(cè)）［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986：1283.

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Establishment and evaluation of HPLC method to determine content of matrine and oxymatrine in Qingre Tonglin Tablet

SUN Lu1，SHI Lei2，LV Wei1，GENG Hong3，WANG Hua1
（1.Department of Pharmacy，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China；2.Department of Pharmacy，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China；3.Jilin Institute for Food ＆Drug Control，Changchun 130033，China）

Objective To establish a new method to determine the contents of matrine and oxymatrine in Qingre Tonglin Tablet by high performance liquid chromatography（HPLC），in order to optimize the quality evaluation and control of Qingre Tonglin Tablet.Methods HPLC method was adopted.Matrine and oxymatrine standards were the control substances and Qingre Tonglin Tablets were the experiment samples.Using Agilent 1200high performance liquid chromatograph，the determination was performed on Genimi－C18（5μm，4.6mm×250mm）column with mobile phase consisting of phosphate buffer solution（PH3.0）－methanol（93∶7）at the flow rate of 0.8mL·min－1.The column temperature was 35℃.The detection wavelength was 220nm and the injection volume was 10μL.For the methodological study，the linearity，specificity，stability，precision and repeatability and accuracy of the HPLC method were tested.Results The regression equation of matrine was Y＝1102.1X＋15.423，showing good linearity（r＝0.999 9）in the range of 0.311 8－4.677 0μg.the average recovery rate was 97.1% （RSD＝0.24%，n＝6）.The regression equation of oxymatrine was Y＝1106.6X＋5.040 2，showing good linearity （r＝0.999 6）in the range of 0.029 8－0.446 4μg；the average recovery rate was 98.4%（RSD＝1.52%，n＝6）.In the tests of stability，precision and repeatability，the RSD of matrine and oxymatrine were respectively 1.21%，1.47%；0.13%，2.76%；0.48% （RSD of the sum of matrine and oxymatrine）.Conclusion HPLC method is simple，sensitive，reliable，specific and has satisfactory separation results，and it is competent for the quality control of Qingre Tonglin Tablet.

high performance liquid chromatography；Qingre Tonglin Tablet；matrine；oxymatrine

R927.2；R284.1

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0894－05

2012－06－13

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題 （200705288）

孫 錄 （1958－），男，吉林省榆樹(shù)市人，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。

孫 錄 （Tel：0431－84997594，E－mail：sunlugood＠163.com）