朱 艷，朱玉廣，鐘瑩瑩，杜孝楠，張 榮，孫學(xué)泉

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科中心濰坊261031

后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)是現(xiàn)代白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥［1］。有研究［2］表明，人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLECs)的間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是PCO的主要病理改變，其中多種細胞因子參與了其發(fā)生過程。轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，從而參與了胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生等多種生物過程［3-5］。該研究利用培養(yǎng)的HLECs，觀察 TGF-β2 對 HLECs增殖的影響，并對TGF-β2 誘導(dǎo)后 HLECs中 E-鈣黏素(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和F-肌動蛋白(F-actin)等與EMT相關(guān)蛋白的表達進行研究，探討TGF-β2對HLECs EMT的影響，制作適合 PCO研究的HLECs模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(GIBCO公司)、兔抗人α-SMA抗體(美國Sigma公司)(按1∶200稀釋)，兔抗人E-cadherin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)(按1∶100稀釋)，兔抗人 F-actin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，RT試劑盒、PCR擴增試劑盒(Casarray公司)。

1.2 HLECs的培養(yǎng)與傳代 晶狀體取自角膜移植術(shù)后供體眼球(死亡時間 ＜24 h，患者年齡 ＜40歲)。體積分?jǐn)?shù)70%乙醇消毒供體眼球，慶大霉素沖洗。在超凈工作臺上解剖眼球，去除角膜和虹膜，沿赤道部剪開晶狀體，將前囊膜切成1 mm×1 mm左右的小塊，種植于培養(yǎng)皿，滴加DMEM培養(yǎng)液2滴，培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱30 min～1 h貼壁。取出培養(yǎng)皿，滴加含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每3～4 d換1次培養(yǎng)液。1～2周近融合，待細胞達約90%融合時，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。傳代后增殖明顯，選擇傳4代的細胞進行實驗［6-7］。

1.3 MTT法檢測TGF-β2對HLECs增殖的影響

HLECs以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種 100 μL，培養(yǎng)24 h 后滴加 TGF-β2，使之終質(zhì)量濃度分別為 0 ng/L(對照組)和 10、33、100、333 和1 000 ng/L，繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48 和 72 h，之后滴加 5 g/L的MTT溶液(每孔20 μL)，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔滴加 DMSO 0.15 mL，振蕩10 min，結(jié)晶充分溶解后，在Powerware XS全波長酶標(biāo)儀上測量其在490 nm處的吸光度(A值)。計算細胞存活率:細胞存活率=處理組A值/對照組A值×100%。根據(jù)MTT比色結(jié)果選擇最佳TGF-β2干涉質(zhì)量濃度、刺激時間。

1.4 細胞分組 制作細胞爬片，待HLECs達80%融合后，血清饑餓培養(yǎng)24 h后分組。實驗分為對照組和TGF-β2組。對照組加入無血清培養(yǎng)基，TGF-β2組加入終質(zhì)量濃度為100 ng/L TGF-β2的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.5 細胞免疫化學(xué)染色法檢測HLECs E-cadherin、α-SMA及F-actin蛋白的表達 對照組和TGF-β2組的細胞爬片進行免疫細胞化學(xué)染色，按試劑說明操作，檢測E-cadherin、α-SMA和F-actin的表達。胞質(zhì)光鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每組各取5張爬片，每張爬片選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，將免疫細胞化學(xué)染色陽性信號投射Imagepro plus顯微圖像分析系統(tǒng)，經(jīng)灰度調(diào)節(jié)后測定陽性細胞的A值進行半定量分析。每組重復(fù)6次。

1.6 RT-PCR 檢測 HLECs E-cadherin及 α-SMA mRNA的表達 收集對照組和TGF-β2組HLECs，Trizol法提取細胞的總RNA，按PCR擴增試劑盒說明步驟，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR反應(yīng)。引物序列:α-SMA(174 bp)，上游 5’-ACTGGGACGACATG GAAAAG-3’， 下 游 5’-CATCTCCAGAGTCCAG CACG-3’;E-cadherin(346 bp)，上游 5’-TCCCAT CAGCTGCCCAGAAA-3’，下游 5’-GGTGAAGGTCG GAGTCAACG-3’;β-actin(231 bp)，上游 5’-ACT CTTCCAGCCTTCCTTCC-3’， 下 游 5’-GTACTT GCGCTCAGGAGGA-3’。擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳檢測，Eagle EyeⅡ型凝膠圖像分析軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。每組重復(fù)6次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進行分析，2組間α-SMA蛋白表達水平的比較應(yīng)用秩和檢驗，其余各指標(biāo)蛋白及mRNA表達水平的比較應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測TGF-β2對HLECs增殖的影響選取10～1 000 ng/L中5個質(zhì)量濃度的 TGF-β2分別作用于 HLECs，作用時間為 12、24、48和 72 h。結(jié)果顯示，HLECs增殖隨著 TGF-β2終質(zhì)量濃度和作用時間的增長而逐漸下降，當(dāng)終質(zhì)量濃度為100 ng/L時達到了最強抑制作用(圖1A)。取TGF-β2終質(zhì)量濃度100 ng/L分別作用于HLECs 12、24、48 和 72 h，HLECs增殖隨 TGF-β2 作用時間增加而逐漸抑制(圖1B)，培養(yǎng)48 h達到了最強抑制作用。

圖1 TGF-β2對HLECs增殖的影響

2.2 細胞免疫化學(xué)法檢測TGF-β2對HLECs轉(zhuǎn)分化的影響 對照組HLECs大量表達E-cadherin，TGF-β2組E-cadherin表達少。對照組HLECs不表達 α-SMA，少量表達 F-actin，TGF-β2 組 α-SMA、F-actin的表達增加(圖2，表1)。

圖2 2組HLECs免疫細胞染色結(jié)果(SP，×400)

表1 對照組和TGF-β2組HLECs中E-cadherin、α-SMA及F-actin蛋白的表達

2.3 RT-PCR 檢測 HLECs E-cadherin及 α-SMA mRNA的表達 圖像分析結(jié)果顯示，TGF-β2抑制E-cadherin mRNA的表達，促進α-SMA mRNA的表達(圖3，表 2)。

圖3 2組HLECs中E-cadherin和α-SMA mRNA的表達

表2 對照組和TGF-β2組HLECs中E-cadherin及α-SMA mRNA的表達

3 討論

PCO引起的后發(fā)性白內(nèi)障是現(xiàn)代白內(nèi)障術(shù)后的主要并發(fā)癥，也是影響術(shù)后視力提高的主要原因［1］。目前仍有不少患者需要行Nd-YAG激光后囊切開。因此，明確PCO的發(fā)病機制和采用有效的防治措施是眼科急待解決的課題之一。EMT是指原本排列緊密的上皮細胞在某些因素的作用下轉(zhuǎn)變成具有類似于成纖維細胞、具有一定游走能力的間質(zhì)細胞的過程［8-9］。具體到眼晶狀體，HLECs的EMT是指HLECs從上皮樣細胞向肌成纖維細胞樣細胞轉(zhuǎn)變的異常分化過程，是PCO的主要病理改變。

E-cadherin是上皮細胞表型的標(biāo)志性蛋白，也是上皮細胞間重要的黏附分子，在維持上皮細胞極性和功能方面起重要的作用［10］。肌成纖維細胞(MFB)是間充質(zhì)的主要組成細胞之一，α-SMA是MFB表型的標(biāo)志性蛋白［11］。因此通過檢測E-cadherin、α-SMA的表達，可以分析上皮細胞的EMT程度。在病理狀態(tài)下HLECs可發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，而高水平α-SMA的表達增強了細胞遷移、侵襲和游走的能力。

目前認為，術(shù)后殘留的HLECs增殖、移行、EMT是引起PCO的主要原因［2］。α-SMA正常表達于平滑肌與心肌，晶狀體中出現(xiàn)α-SMA為PCO的標(biāo)志，因此，α-SMA可作為研究HLECs EMT的指標(biāo)。在EMT的發(fā)生過程中，多種細胞因子參與了其發(fā)生過程［12］，TGF-β2可以誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生，從而參與了胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生等多種生物過程［3］。目前，在 PCO研究中，尚未完全明確刺激HLECs增殖、移行和EMT產(chǎn)生的信號因子，但在離體后發(fā)障模型的實驗［13］中，己證明某些細胞因子在后發(fā)障形成過程中起作用。TGF-β2是重要的調(diào)節(jié)因子［13-16］，與囊膜下型白內(nèi)障以及PCO的發(fā)生有密切關(guān)系。研究［13-16］發(fā)現(xiàn)，TGF-β2能夠誘導(dǎo) HLECs發(fā)生異常的生長和分化，并發(fā)生凋亡，導(dǎo)致體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體發(fā)生前囊膜下渾濁。

作者發(fā)現(xiàn)，TGF-β2可抑制HLECs的增殖和E-cadherin的表達，促進HLECs α-SMA及F-actin的表達。上皮細胞表型標(biāo)志物E-cadherin的表達下降，肌纖維母細胞的標(biāo)志蛋白α-SMA表達增強，表明TGF-β2能夠誘導(dǎo)HLECs向肌纖維母樣細胞轉(zhuǎn)化，促進了PCO的形成。因此在PCO的研究中，TGF-β2可以作為適宜的 EMT誘導(dǎo)因子。目前有關(guān)TGF-β2對PCO的作用及相關(guān)信號通道的研究較少，因此，利用 TGF-β2作為刺激因子，可以制作HLECs EMT細胞模型，在細胞及分子水平上研究PCO的發(fā)生機制，為下一步的信號通道研究打下基礎(chǔ)，同時也為PCO的防治指明了方向。

［1］Kohnen T.Preventing posterior capsule opacification:what have we learned?［J］.J Cataract Refract Surg，2011，37(4):623

［2］Yao K，Ye PP，Tan J，et al.Involvement of PI3K/Akt pathway in TGF-beta2-mediated epithelial mesenchymal transition in human lens epithelial cells［J］.Ophthalmic Res，2008，40(2):69

［3］Lois N，Taylor J，McKinnon AD，et al.Effect of TGF-beta2 and anti-TGF-beta2 antibody in a new in vivo rodent model of posterior capsule opacification［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(11):4260

［4］晁煒靜，李康華，戴榮平，等.人脂肪間充質(zhì)干細胞體外分化為視網(wǎng)膜細胞觀察［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，45(3):407

［5］徐春玲，蘇冠方，張文杰，等.骨髓間充質(zhì)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞分化過程中的電生理特性［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2011，37(5):773

［6］陶津華，安小玲，孔郡，等.EGF體外對人晶狀體上皮細胞遷移的影響［J］.國際眼科雜志，2006，6(1):68

［7］朱艷，朱玉廣，張立華，等.整合素 β1介導(dǎo)的 ERK/MAPK通道在晶狀體上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用［J］.眼科新進展，2012，34(4):318

［8］盧思廣，劉健勝，于艷輝.腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機制的研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2011，26(17):1311

［9］周寶尚，張璟，陶光利.shRNA干擾 β-catenin對 TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2011，33(20):2166

［10］Kim NG，Koh E，Chen X，et al.E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(29):11930

［11］Kim CD，Sohn KC，Lee SS，et al.Plasminogen activator inhibitor-2(PAI-2)secreted from activated mast cells induces α-smooth muscle actin(α-SMA)expression in dermal fibroblasts［J］.J Dermatol Sci，2011，62(3):204

［12］Fragiadaki M，Mason RM.Epithelial-mesenchymal transition in renal fibrosis-evidence for and against［J］.Int J Exp Pathol，2011，92(3):143

［13］Srinivasan Y，Lovicu FJ，Overbeek PA.Lens-specic expression of transforming growth factor β1 in transgenic mice causes anterior subeapsular cataracts［J］.J Clin Investig，1998，101(3):625

［14］Maruno KA，Lovicu FJ，Chamberlain CG，et al.Apoptosis is a feature of TGF beta-induced cataract［J］.Clin Exp Optom，2002，85(2):76

［15］Hales AM，Chamberlain CG，McAvoy JW.Cataract induction in lenses cultured with transforming growth factor-β［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36(8):1709

［16］Gordon-Thomson C，de Iongh RU，Hales AM，et al.Differential cataractgenic potency of TGF-beta 1，beta 2，and beta 3 and their expression in the postnatal rat eye［J］.Invest Ohthalmol Vis Sci，1998，39(8):1399