鄭湘予，龐 霞，李晟磊，朱志強(qiáng)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科鄭州450052

CXCR4是G蛋白耦聯(lián)的7次跨膜蛋白受體，其與特異性配體趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)構(gòu)成的生物學(xué)軸激活的特殊信號(hào)傳導(dǎo)途徑，對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至好發(fā)部位種植、存活和增殖起關(guān)鍵作用［1］。作者采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞的內(nèi)源性CXCR4表達(dá)水平，用Boyden小室體外細(xì)胞侵襲模型檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA(small interference RNA，siRNA)后細(xì)胞體外侵襲能力的變化，以期尋找膀胱癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制中的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株由上海細(xì)胞研究所提供。PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京奧科生物技術(shù)有限公司，兔抗人CXCR4單克隆抗體購(gòu)自R＆D Systems公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，siRNA和LipofectamineTM2000均購(gòu)自廣州銳博公司，基底膜基質(zhì)膠Matrigel matrix購(gòu)自美國(guó)BD公司。Boyden小室購(gòu)自江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.2 CXCR4 siRNA設(shè)計(jì)、合成及純化 根據(jù)人CXCR4基因序列(NM003467)設(shè)計(jì)如下序列:CXCR4siRNA:正 義 鏈 5’-UAAAAUCUUCCUGC CCACC-3’， 反 義 鏈 3’-AUUUUAGAAG GACGGGUGG-5’;無(wú)關(guān)序列 dsRNA:正義鏈 5’-UU CUCCGAACGUGUCACGU-3’，反義鏈 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAA-3’。以上siRNA序列均由廣州銳博公司合成、純化。為了避免可能偏靶，采用了嚴(yán)格的BALST進(jìn)行比對(duì)，在GenBank中證實(shí)CXCR4 siRNA僅與CXCR4基因存在相應(yīng)的匹配位點(diǎn)，無(wú)關(guān)序列dsRNA與任何已知哺乳動(dòng)物基因無(wú)匹配。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株采用無(wú)抗生素、含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的條件下培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度，接種至6孔板，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%融合時(shí)，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分成3組:空白對(duì)照組(轉(zhuǎn)染時(shí)只加脂質(zhì)體)，陰性對(duì)照組(應(yīng)采用無(wú)關(guān)序列RNA轉(zhuǎn)染)，siRNA轉(zhuǎn)染組(采用CXCR4 siRAN轉(zhuǎn)染)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染前后、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 T24細(xì)胞CXCR4 mRNA的表達(dá) 應(yīng)用RTPCR檢測(cè) 。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2～3次，按Trizol說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。CXCR4上游引物:5’-AATCTTCCTGCCCAC CATCT-3’;下游引物是:5’-GACGCCAACATAGAC CACCT-3’，產(chǎn)物大小為367 bp;內(nèi)參β-actin:上游引物:5’-CATCCTGCGTCTGGACCT-3’;下游引物:5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，產(chǎn)物大小為480 bp。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，58℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，接著72℃繼續(xù)延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀成像觀察。

1.5 T24細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá) 應(yīng)用Western blot法分析。siRNA轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，制備SDS-PAGE凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次與CXCR4抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)1 h，曝光顯影，沖洗膠片，用紫外分光光度計(jì)掃描條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.6 體外趨化侵襲能力檢測(cè) 收獲上述3組細(xì)胞，分別用不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至5×108L－1。Boyden小室經(jīng)紫外線照射2 h滅菌，將鋪好Matrigel Matrix的膜平鋪于下室上，膜上加鋪硅膠墊片，并蓋好頂板。在上室的微孔中各加入細(xì)胞懸液25 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。取出膜，輕輕擦去Matrigel Matrix上未轉(zhuǎn)移至膜上的細(xì)胞，將膜用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇固定45 min，未結(jié)合型蘇木素染色5 min，流水沖洗終止反應(yīng)。光學(xué)顯微鏡下觀察遷徙至膜上的細(xì)胞，每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野(×100)中的細(xì)胞數(shù)總和，求其平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0處理數(shù)據(jù)，各組T24細(xì)胞CXCR4蛋白和mRNA表達(dá)、穿膜細(xì)胞數(shù)比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，生長(zhǎng)旺盛;而轉(zhuǎn)染72 h后siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞集落減少，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞碎片增多，見(jiàn)圖1。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染前后T24細(xì)胞的形態(tài)變化(×400)

2.2 各組T24細(xì)胞CXCR4 mRNA的表達(dá) 見(jiàn)圖2、表 1。

圖2 各組T24細(xì)胞CXCR4 mRNA的表達(dá)

2.3 各組T24細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖3、表1。

圖3 各組T24細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá)

表1 各組T24細(xì)胞CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)

2.4 各組T24細(xì)胞體外侵襲能力 空白對(duì)照、陰性對(duì)照、siRNA轉(zhuǎn)染組T24細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(119.20 ± 7.33)、(117.80 ± 12.15)、(40.80 ±5.02)，3 者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=133.247，P＜0.001)。siRNA轉(zhuǎn)染組T24細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對(duì)照和陰性對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

膀胱移行細(xì)胞癌在我國(guó)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率居第一位。其主要的特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率較高，復(fù)發(fā)后腫瘤惡性度增高，浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性行為增強(qiáng)。文獻(xiàn)［2］報(bào)道50% ～80%的膀胱移行細(xì)胞癌患者在第一次術(shù)后復(fù)發(fā)，其中10% ～15%最終進(jìn)展為浸潤(rùn)性的高度惡性的腫瘤。因此，早期診斷和阻止膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

趨化因子受體CXCR4的天然配體CXCL12是CXC類趨化因子，它們通過(guò)耦聯(lián)G蛋白發(fā)揮信息傳遞作用［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，CXCL12 和 CXCR4 構(gòu)成的生物學(xué)軸在多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究［5］發(fā)現(xiàn)人乳癌細(xì)胞系高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，乳癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶也高表達(dá)CXCR4，而在乳癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位如肺、淋巴結(jié)、肝臟和骨髓則高水平地表達(dá)其配體CXCL12。CXCL12/CXCR4在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用亦分別在非小細(xì)胞肺癌、橫紋肌肉瘤、惡性黑色素瘤、鼻咽癌等多種腫瘤細(xì)胞的研究中得到證實(shí)［6-9］。

作者將體外轉(zhuǎn)錄合成的CXCR4 siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后，采用RT-PCR和Western blot方法分析靶基因CXCR4 mRNA及蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果表明，CXCR4 siRNA有效降低CXCR4蛋白和基因的表達(dá)。為了檢測(cè)CXCR4對(duì)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和浸潤(rùn)能力的影響，作者采用Boyden小室體外細(xì)胞侵襲模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比明顯減少，推測(cè)CXCR4基因有促進(jìn)細(xì)胞侵襲的作用。

綜上所述，CXCR4在膀胱癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)CXCR4的深入研究不但能進(jìn)一步了解腫瘤的生物學(xué)行為的變化，還可以為開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供思路。

［1］張霖，史玉榮，魏熙胤，等.趨化因子受體4下調(diào)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2007，24(11):1401

［2］De Falco V，Guarino V，Avilla E，et al.Biological role and potential therapeutic targeting of the chemokine receptor CXCR4 in undifferentiated thyroid cancer［J］.Cancer Res，2007，67(24):11821

［3］Balkwill F.Chemokine biology in cencer［J］.Semin Immunol，2003，15(1):49

［4］Furusato B，Mohamed A，Uhlén M，et al.CXCR4 and cancer［J］.Pathol Int，2010，60(7):497

［5］Lee CH，Kakinuma T，Wang J，et al.Sensitization of B16 tumor cells with a CXCR4 antagonist increases the efficacy of immunotherapy for established lung metastases［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(10):2592

［6］Irigoyen M，Ansó E，Martínez E，et al.Hypoxia alters the adhesive properties of lymphatic endothelial cells:a transcriptional and functional study［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(6):880

［7］Strahm B，Durbin AD，Sexsmith E，et al.The CXCR4-SDF1 alpha axis is a critical mediator of rhabdomyosarcoma metastatic signaling induced by bone marrow stroma［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25(1):1

［8］Hu J，Deng X，Bian X，et al.The expression of functional chemokine receptor CXCR4 is associated with the metastatic potential of human nasopharyngeal carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2005，11(13):4658

［9］Ou DL，Chen CL，Lin SB，et al.Chemokine receptor expression profiles in nasopharyngeal carcinoma and their association with metastasis and radiotherapy［J］.J Pathol，2006，210(3):363