崔文燕，郭 明，原 園，周福有，張 朋，王偉鵬，趙學(xué)科，陳元方，任景麗，王立東#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院癌癥研究中心新鄉(xiāng)453003 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室鄭州450052 3)安陽腫瘤醫(yī)院外科安陽455000 4)磁縣醫(yī)院病理科磁縣056500 5)鶴壁市衛(wèi)生局鶴壁458030 6)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科鄭州450014

臨床上首次就診的食管癌患者中，95%以上為中晚期患者［1］，其預(yù)后極差，5 a生存率僅為10%左右［2］，臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等被認(rèn)為是影響食管癌預(yù)后的重要因素［3-6］。該研究通過分析食管癌組織中23種腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)與食管癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及臨床分期之間的關(guān)系，尋找與食管癌預(yù)后相關(guān)的重要候選蛋白。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來自河南省食管癌重點開放實驗室積累的2000年至2011年食管癌手術(shù)切除標(biāo)本，且均經(jīng)病理學(xué)證實為鱗狀細(xì)胞癌。679例患者術(shù)前未經(jīng)放化療或免疫治療，其中男440例，年齡38～85(59.2 ±8.4)歲;女 239 例，年齡 33 ～82(60.9 ±7.9)歲;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有258例，無401例(20例不詳);分化程度:低分化321例，中分化292例，高分化41例(25例不詳);臨床分期:早期66例，中晚期585例(28例不詳)。

1.2 23種蛋白的免疫組織化學(xué)檢測 采用ABC法檢測23種腫瘤相關(guān)蛋白(各蛋白檢測例數(shù)見表1)，包括:信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、細(xì)胞分化增殖相關(guān)蛋白、凋亡和修復(fù)相關(guān)蛋白和細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白等。單克隆抗體(7 種):Fascin、CK5/6、CK20、CD56、CD117、MUC1、AE1/AE3;多克隆抗體(16 種):P53、P63、Ki67、Ezrin、CK、PLK1、CK18、CD34、E-cad、NSE、CTTN、Syn、CgA、S100、Vim、C-myc。ABC 試劑盒和DAB底物試劑盒購自美國Vector公司，小牛凍干血清蛋白購自美國Sigma公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，用已知的食管癌組織切片作陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。

根據(jù)23種蛋白著色部位的不同，陽性染色評定標(biāo)準(zhǔn)分為2種。①細(xì)胞核著色(5種，分別是P63、P53、CD56、Ki67和C-myc):陽性反應(yīng)呈棕黃色或棕褐色顆粒。定性:無染色為0分，明顯高于背景者為1分，有較多棕黃色顆粒者為2分，有大量深棕黃色顆粒者為3分;定量:高倍鏡下隨機(jī)觀察至少5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞，取均值，陽性細(xì)胞數(shù)比例＜5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，＞51%為3分，定性和定量評分之和≤1分者為陰性，＞1者為陽性。②胞質(zhì)著色(余18種):陽性反應(yīng)表現(xiàn)為棕黃色或淡黃色顆粒。定性:無染色為0分，明顯高于背景者1分，有較多棕黃色顆粒者2分，有大量深棕黃色顆粒者3分。定量:高倍鏡下隨機(jī)觀察至少5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞，取均值，陽性細(xì)胞數(shù)比例＜5%為0分，～25%為1分，～75%為2分，＞75%為3分。定性和定量評分之和≤1分者為陰性，＞1分者為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，運用χ2檢驗、校正χ2檢驗或精確概率法分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床分期等因素與23種腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系，缺失數(shù)據(jù)不參與相關(guān)指標(biāo)的分析。檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中23種蛋白的表達(dá)情況 見表1。在食管癌組織中，陽性率較高(≥80%)的蛋白是AE1/AE3、P63、CK5/6、CK、Ki67、MUC1;其次(50% ～80%)是 CD34、Fascin、E-cad、P53、C-myc、Vim、Ezrin;表達(dá)較低(≤50%)的是 NSE、CD117、CK18、PLK1、CD56、CTTN、Syn、S100、CgA、CK20，見表1。

表1 食管癌組織中23種蛋白的表達(dá)情況

2.2 23種蛋白與食管癌患者臨床病理因素的關(guān)系13種蛋白與食管癌患者臨床病理因素?zé)o關(guān)，10種蛋白與食管癌患者臨床病理因素有關(guān)，見表2。

表2 10種蛋白與患者臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

該研究分析了23種腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)與食管癌患者臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Syn、CD56和Ki67高表達(dá)分別與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化和臨床中晚期有關(guān)，提示這一組分子變化可能是評價食管癌預(yù)后差的重要候選指標(biāo);而 P63、E-cad、Fascin、Ezrin、PLK1、Vim和CTTN高表達(dá)則分別與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、中高分化和臨床早期有關(guān)，提示這一組分子變化可能是評價食管癌預(yù)后好的重要候選指標(biāo)。

國內(nèi)外研究報道這10種蛋白與食管癌預(yù)后的關(guān)系不盡相同。有研究［7］報道，Syn、CD56和 Ki67高表達(dá)與食管癌預(yù)后不良有關(guān);P63、E-cad、Fascin、Ezrin、PLK1、Vim和CTTN高表達(dá)與食管癌預(yù)后好密切相關(guān)［8-9］;但也有報道［10-11］Ezrin、Fascin 等蛋白高表達(dá)與食管癌預(yù)后不良有關(guān)。研究結(jié)果的不同可能是由于單純分析某一指標(biāo)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及臨床分期之間的關(guān)系，且用于判斷蛋白與預(yù)后的關(guān)系存在很多客觀和主觀因素，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量重復(fù)驗證，并將這些指標(biāo)聯(lián)合檢測才能為判斷食管癌預(yù)后提供更好的依據(jù)。

該研究研究結(jié)果提示:①食管癌預(yù)后過程涉及多種腫瘤相關(guān)蛋白，食管癌預(yù)后分子基礎(chǔ)很復(fù)雜。②許多腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)改變發(fā)生在食管癌早期階段，這些蛋白在早期即可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體，檢測這些自身抗體的血清水平，可在一定程度上反映食管癌病變程度［12-14］，這些指標(biāo)有可能成為判斷食管癌預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，為探討食管癌預(yù)后的分子基礎(chǔ)提供依據(jù)。

該研究所選擇的蛋白指標(biāo)是依據(jù)河南、河北幾家醫(yī)院病理科食管癌組織免疫組化指標(biāo)篩選所得，很顯然，這些蛋白并不能完全反映食管癌預(yù)后所涉及的全部蛋白，進(jìn)一步通過人群隨訪、擴(kuò)大樣本量，驗證這些蛋白對食管癌預(yù)后的生物學(xué)意義，從中優(yōu)化組合出最具代表性的幾組蛋白，制備成檢測蛋白芯片，將能提高食管癌早期篩查的靈敏度和特異度，為提高食管癌預(yù)后5 a生存率提供新的靶點和思路。

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