劉俊渤，王 麗，胡耀輝，朱玉婷，于寒松

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

鹿是一種珍貴的、具有藥用作用的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物.隨著我國(guó)鹿業(yè)市場(chǎng)的拓展和逐步成熟，每年都有大量鹿油得不到充分利用.鹿油富含飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等多種功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其作為藥物使用早在《唐本草》與《中國(guó)醫(yī)學(xué)大辭典》就有記載.1999年朱秋勁等［1］對(duì)鹿油脂肪酸成分進(jìn)行了分析.目前關(guān)于鹿油的提取、精煉及深加工技術(shù)等方面的相關(guān)研究很少，因此鹿油的研究前景廣闊.

目前動(dòng)物油提取的方法有直接熬制法、蒸煮法、溶劑法、酶解法、超臨界流體萃取法等.隨著人們對(duì)綠色產(chǎn)品的不斷追求，超臨界流體萃取技術(shù)越來(lái)越受到研究學(xué)者的關(guān)注［2］.超臨界流體尤其是超臨界CO2萃取技術(shù)，具有工藝簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)污染、低溫操作及抗氧化滅菌［3-6］等特點(diǎn)，它克服了傳統(tǒng)提取法易氧化酸敗、溶劑殘留等問題，尤其對(duì)熱敏性及易揮發(fā)生物功能性物質(zhì)具有良好的保護(hù)作用，從而保證了鹿油的品質(zhì)與功能，這對(duì)鹿油在醫(yī)藥保健品、化妝品、環(huán)保［7-8］、食品［9］、化工［10］等領(lǐng)域中的應(yīng)用有著重要意義.但是超臨界CO2萃取也存在時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)率低等問題，因此，本研究以鹿肉為原料，采用正交試驗(yàn)，通過控制萃取溫度、壓力、時(shí)間因素，探討了超臨界CO2萃取鹿油的最佳工藝，同時(shí)對(duì)超臨界萃取的鹿油進(jìn)行脂肪酸組成及基本理化性質(zhì)的分析，旨在為鹿油生產(chǎn)應(yīng)用提供理論支持，同時(shí)也為鹿油開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

梅花鹿肉，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)梅花鹿養(yǎng)殖場(chǎng)提供.

CO2(φ＞99.5%)，長(zhǎng)春市氧氣廠;乙醇(φ＞99.7%)、乙醚(φ＞99.5%)、碘化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鉀、硫代硫酸鈉，天津市化學(xué)試劑三廠;冰醋酸(φ＞99.5%)、鹽酸、硫酸、四氯化碳，北京化工廠.

Spe-ed Sfe-2/4超臨界CO2萃取儀，美國(guó)Applied Separations;DZF-6020真空干燥箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司;KQ5200DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(5975)，Agilent公司.

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將新鮮的鹿肉清洗除雜、冷凍粉碎，在相對(duì)真空度0.09 MPa、溫度90℃條件下干燥2 min后降溫至40～50℃下干燥，使鹿肉含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06% ～0.08%，干燥后在40 kHz、40℃下超聲20 min，備用.

1.2.2 工藝流程與操作流程 鹿肉→除雜粉碎→干燥脫水→超聲→裝料→萃取→鹿油.

稱取15.00 g預(yù)處理后的鹿肉原料裝入反應(yīng)釜，加蓋擰緊，裝入反應(yīng)器中，升溫、加壓，調(diào)CO2流量至400 mL/min，萃取一定時(shí)間后收集鹿油.鹿油萃取率計(jì)算公式:鹿油萃取率 =鹿油質(zhì)量/鹿肉質(zhì)量 ×100%.

1.2.3 單因素試驗(yàn) 萃取壓力的優(yōu)化:稱取15.00 g預(yù)處理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，萃取溫度40℃、萃取時(shí)間90 min，萃取壓力分別為15、20、25、30、35、40 和 45 MPa，采用超臨界 CO2萃取鹿油，研究萃取壓力對(duì)鹿油萃取率的影響.

萃取溫度的優(yōu)化:稱取15.00 g預(yù)處理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，萃取時(shí)間90 min，萃取壓力35 MPa，萃取溫度分別為30、35、40、45、50、55和60℃，采用超臨界CO2萃取鹿油，研究萃取溫度對(duì)鹿油萃取率的影響.

萃取時(shí)間的優(yōu)化:稱取15.00 g預(yù)處理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，萃取溫度40℃，萃取壓力35 MPa，萃取時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180和210 min，采用超臨界CO2萃取鹿油，研究萃取時(shí)間對(duì)鹿油萃取率的影響.

1.2.4 正交試驗(yàn) 影響超臨界CO2萃取的因素很多［11-15］，其中，萃取壓力(p萃取)、萃取溫度(θ萃取)和萃取時(shí)間(t萃取)是影響超臨界流體萃取率的重要因素.在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上篩選出萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間的影響水平，進(jìn)行L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，以萃取率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn).進(jìn)料量15.00 g，CO2流量400 mL/min.

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 L9(34)Orthogonal experiment factors and levels

1.2.5 鹿油理化指標(biāo)測(cè)定［16］肉眼觀察色澤;參考GB/T 5532—85測(cè)定碘價(jià);參考 GB/T 5534—85測(cè)定皂化值;參照GB/T 5530—85測(cè)定酸價(jià).

1.2.6 鹿油脂肪酸成分分析 將最優(yōu)萃取條件下得到的鹿油樣品采用GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行脂肪酸成分分析.氣相色譜-質(zhì)譜條件:玻璃毛細(xì)管柱(60.00 mm×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫條件:起始溫度100℃，然后以10℃/min的速度升至230℃，恒溫40 min;進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣:高純氦氣，流速為1 mL/min，分流體積比10∶1;接口溫度:250℃;電離方式:EI;電子能量:70 eV，離子溫度230℃，四極桿溫度150℃;調(diào)諧方式:標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧;質(zhì)量掃描方式:SCAN;溶劑延遲:3 min;掃描質(zhì)量范圍:10～550 amu;電子倍增器電壓:1.635 V.

1.3 鹿油樣品分析

準(zhǔn)確稱取鹿油樣品0.100 0～0.200 0 g，加異辛烷溶解定容至10.0 mL，混勻，用微量注射器吸取50 μL于10 mL刻度試管中，加入0.4 mol/L KOH-甲醇溶液2.0 mL，置漩渦混合器2 min，室溫放置10 min.再加入異辛烷1.95 mL，再置旋渦混合器2 min，加80 g/L NaCl溶液至10 mL刻度，以2 000 r/min離心10 min，吸出上清液(異辛烷層)于2 mL小試管中，在上述GC/MS分析條件下，進(jìn)樣1μL，以峰保留時(shí)間及譜庫(kù)檢索定性，與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較定量.

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界萃取條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 萃取壓力對(duì)鹿油萃取率的影響 由圖1a可

知，隨著萃取壓力升高，鹿油提取率也隨著逐步增大.當(dāng)萃取壓力從15 MPa升到35 MPa時(shí)，鹿油提取率增大顯著;當(dāng)萃取壓力超過35 MPa后，鹿油萃取率的增加變得緩慢，但仍呈現(xiàn)持續(xù)增加的狀態(tài).壓力對(duì)萃取率的影響比較顯著，壓力增大可增加CO2的密度，使分子間平均自由程減小，有利于擴(kuò)散與滲透，進(jìn)而提高了超臨界CO2對(duì)鹿油的萃取率.但當(dāng)壓力增大到一定程度后，由于壓力改變對(duì)溶質(zhì)的溶解度影響很小，因此萃取率無(wú)明顯提高，且從能源、經(jīng)濟(jì)等綜合因素考慮，鹿油萃取壓力以30～40 MPa為宜.

2.1.2 萃取溫度對(duì)鹿油萃取率的影響 由圖1b可知，在萃取壓力35 MPa，萃取時(shí)間90 min條件下，隨著溫度的升高，鹿油萃取率增大明顯，當(dāng)萃取溫度超過40℃后，其萃取率增大緩慢，而當(dāng)溫度超過50℃后，鹿油萃取率反而出現(xiàn)下降趨勢(shì).這是因?yàn)闇囟葘?duì)鹿油提取率的影響十分復(fù)雜，在一定的壓力下，升高溫度，可降低超臨界CO2流體的運(yùn)動(dòng)黏度，提高系統(tǒng)中流體分子的熱運(yùn)動(dòng)速率，增大分子的擴(kuò)散能力，從而使溶質(zhì)的溶解度增加，有利于鹿油的浸出.但升高溫度的同時(shí)，超臨界CO2的密度降低，不利于溶質(zhì)在流體中溶解，反而使鹿油萃取率降低，并且溫度過高，儀器設(shè)備的使用壽命也會(huì)受到影響，綜合因素考慮，鹿油萃取溫度以40～50℃為宜.

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)鹿油萃取率的影響 萃取時(shí)間對(duì)超臨界CO2萃取鹿油有顯著影響.超臨界萃取屬于擴(kuò)散過程，需要一定時(shí)間才能萃取充分.萃取初期，由于溶劑的擴(kuò)散速率緩慢，萃取率較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑擴(kuò)散能力增強(qiáng)，萃取率增大.從圖1c可知，在萃取溫度40℃、萃取壓力35 MPa條件下，萃取時(shí)間越長(zhǎng)鹿油萃取率越高.在30～120 min時(shí)間內(nèi)，鹿油萃取率隨著萃取時(shí)間的增加而顯著提高，但120 min后，隨著萃取時(shí)間的增加鹿油萃取率基本趨于平緩，因此鹿油萃取時(shí)間以120～180 min為宜.

圖1 萃取條件對(duì)鹿油得率的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on the yield of deer oil

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的的正交設(shè)計(jì)方案，在9種不同工藝條件下萃取鹿油，分別測(cè)定其萃取率，結(jié)果見表2.表2的極差分析結(jié)果表明，超臨界萃取3個(gè)因素對(duì)鹿油萃取率的影響順序?yàn)?萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時(shí)間，鹿油的最佳萃取方案為A2B3C2，即最佳萃取工藝條件組合為萃取溫度45℃，萃取壓力40 MPa，萃取時(shí)間150 min.

2.3 最佳萃取條件驗(yàn)證

在上述最佳條件下(萃取溫度45℃、萃取壓力40 MPa、萃取時(shí)間150 min)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，其鹿油萃取率分別為32.22%、32.28%和32.25%，由萃取率可看出，最佳萃取工藝條件具有較好的重復(fù)性，鹿油萃取率較高，說(shuō)明該工藝條件是合理的、可靠的.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experiment results

2.4 鹿油理化指標(biāo)分析

對(duì)在萃取溫度45℃、萃取壓力40 MPa、萃取時(shí)間150 min條件下萃取所得鹿油進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，超臨界萃取的鹿油呈純白色固體絮狀，質(zhì)量濃度為0.907 g/mL，碘值為37.55，酸價(jià)為1.08 mg/g，皂化值為178.5 mmol/g.碘值、酸價(jià)和皂化值都是檢測(cè)油脂品質(zhì)的基本理化指標(biāo)，碘值是衡量鹿油不飽和酸含量的指標(biāo)，酸值是衡量鹿油游離脂肪酸含量的指標(biāo)，皂化值則是衡量鹿油脂肪酸相對(duì)分子質(zhì)量大小的指標(biāo).超臨界萃取的鹿油酸價(jià)為1.08 mg/g，說(shuō)明超臨界CO2萃取的鹿油游離脂肪酸較少，酸敗程度較低，具有良好的應(yīng)用前景.

2.5 鹿油脂肪酸組成含量檢測(cè)分析

將超臨界CO2最佳萃取工藝條件下所得鹿油直接甲酯化，得鹿油脂肪酸甲酯色譜圖(圖2).采用面積歸一法計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3.由表3可知，鹿油含有多種飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到41.94%，其中油酸(十八碳烯酸)和亞油酸(十八碳二烯酸)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，油酸具有極佳的滲透性，不僅能夠降低膽固醇、防止大腦衰弱，同時(shí)能夠保護(hù)皮膚，防止皮膚損傷和衰老，保持皮膚光滑細(xì)膩，也可作潤(rùn)滑劑，減少制品變形，增加表面光潔度，在化妝品和塑料行業(yè)中廣泛應(yīng)用;亞油酸具有滋潤(rùn)護(hù)膚的作用，還具有抗癌作用，同時(shí)能夠提高人體免疫力，減少人體脂肪沉積，有良好的減肥功效.飽和脂肪酸中以棕櫚酸(十六烷酸)和硬脂酸(十八烷酸)含量最高，棕櫚酸是制作肥皂的良好原料之一，硬脂酸和棕櫚酸都可以用來(lái)做乳化劑，使得到的膏體穩(wěn)定潔白.因此，鹿油將在醫(yī)藥保健品、化妝品等行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景.

圖2 鹿油脂肪酸甲酯色譜圖Fig.2 Fatty acid methyl esters chromatogram of deer oil

表3 鹿油中各脂肪酸成分與含量Tab.3 Chemical compositions and contents of fatty acids in deer oil

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，確定了超臨界CO2萃取鹿油的最佳工藝條件為萃取溫度45℃、萃取壓力40 MPa、萃取時(shí)間150 min.萃取的鹿油為純白色，無(wú)雜質(zhì)，富含多種飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其碘值為37.55，酸價(jià)為1.08 mg/g，皂化值為178.5 mmol/g.本研究不僅為超臨界CO2萃取技術(shù)在動(dòng)物油脂提取中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了可靠依據(jù)，也為鹿油的深層次開發(fā)奠定了基礎(chǔ).

［1］朱秋勁，李俐，國(guó)興民，等.梅花鹿鹿油肪酸組分的氣象色譜分析［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，1999，18(5):337-339.

［2］SOVOVA H，ZAREVUCKA M，VACEK M，et al.Solubility of two vegetable oils in supercritical CO2［J］.Journal of Supercritical Fluids，2001(20):15-28.

［3］趙墾田，孫俊，李德海.超臨界CO2流體萃取技術(shù)在植物資源開發(fā)中的應(yīng)用［J］.特產(chǎn)研究，2006(3):61-64.

［4］張君萍，侯喜林，董海艷，等.沙蔥籽油的超臨界CO2萃取及成分分析［J］.食品科學(xué)，2001，32(6):53-56.

［5］XU Juan，CHEN Shu-bing，HU Qiu-hui.Antioxidant activity of brown pigment and extracts from black sesame seed(Sesamum indicum L.)［J］.Food Chemistry，2005，91(1):79-83.

［6］CHUANG Ping-hsien，LEE Chi-wei，CHOU Jia-ying，et al.Anti-ungal activity of crude extracts and essential oil of moringa oleifera lam［J］.Bioresource Technology，2007，98(1):232-236.

［7］ROBINSON W E J.L-Chicoric acid，an inhibitor of human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)integrase，improves on the in vitro anti-HIV-1 effect of Zidovudine plus a protease inhibitor(AG1350)［J］.Antiviral Res，1998，39:101-111.

［8］陶小工，梅成效，王挺.超臨界流體技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用研究［J］.化工礦物與加工，2003(4):33-37.

［9］MUNOZ M，GUEVARA L，PALOP A，et al.Determination of the effect of plant essential oils obtained by supercritical fluid extraction on the growth and viability of Listeria monocytogenes in broth and food systems using flow cytometry［J］.LWT-Food Science and Technology，2009，42:220-227.

［10］尹獻(xiàn)忠，石國(guó)強(qiáng)，胡軍，等.超臨界流體新技術(shù)在煙用香精工業(yè)中的應(yīng)用展望［J］.煙草科技，2003(11):27-31.

［11］王靜，郝小松，孫林濤，等.蠶蛹鹿油的超臨界二氧化碳萃取工藝及分析［J］.食品科學(xué)，2009，30(22):112-115.

［12］張建立，李延升.超臨界CO2萃取柑橘精油的工藝研究［J］.廣州化工，2011，39(10):85-87.

［13］楊柳，陶寧萍.超臨界CO2萃取大蒜中蒜素工藝參數(shù)的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2009，30(16):137-141.

［14］胡錫波，熊耀康.超臨界二氧化碳萃取楊梅核仁油的工藝研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010(36):1-3.

［15］PAPAMICHAIL I，LOULI V，MAGOULAS K.Supercritical fluid extraction of celery seed oil［J］.Journal of Supercritical Fluids，2000，18(3):213-226.

［16］馬濤.糧油食品檢驗(yàn)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008:233-235.