朱 麗，盧艷梅，區(qū)志鑌，樂學(xué)義

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，廣東廣州510642)

苯并咪唑衍生物具有良好的生物活性，可作為抗菌、抗病毒和殺蟲劑以及抗癌藥物等［1-2］，尤其是這些化合物與某些過渡金屬離子結(jié)合形成配合物時可提高其生物活性，并且這種活性可能與化合物對DNA的作用有關(guān)，因此苯并咪唑衍生物金屬(尤為過渡金屬)配合物與DNA相互作用及其應(yīng)用受到人們廣泛關(guān)注［3-7］.另外，人們研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在金屬配合物中插入L-α-氨基酸等生物配體時，能夠增強(qiáng)藥物對生物細(xì)胞膜的滲透作用等，從而進(jìn)一步提高配合物的生物活性［8］，因此研究含L-α-氨基酸及苯并咪唑衍生物過渡金屬配合物有重要意義.

本文以重要的苯并咪唑衍生物2-(4'-噻唑基)苯并咪唑(圖1)作為第1配體，L-丙氨酸為第2配體，重要生命元素銅(Ⅱ)作為中心離子合成了新的三元配合物［Cu(TBZ)(L-Ala)(H2O)］ClO4［其中TBZ=2-(4'-噻唑基)苯并咪唑，L-Ala=L-丙氨酸根］(以下簡稱配合物).通過二倍試管稀釋法研究了配合物的抑菌活性，并采用電子吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜、粘度測定及瓊脂凝膠電泳等方法研究了該配合物與DNA的相互作用，為研制新型高效抗菌劑提供科學(xué)依據(jù).

圖1 2-(4'-噻唑基)苯并咪唑的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of 2-(4'-thiazolyl)benzimidazole

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Vario EL元素分析儀(ELEMENTAR公司);ACATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀(美國Nicolet公司);Shimadzu UV-2550型紫外/可見分光光度計(日本Shimadzu公司);DDS-12A型電導(dǎo)率儀(上海宇隆儀器有限公司);F-4500熒光光譜儀(日本HITACHI公司);JASCO-810型圓二色光譜儀(日本JASCO公司);烏氏粘度計(上海晶菱玻璃有限公司);BIORAD凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Laboratories-Segrate意大利米蘭).

2-(4'-噻唑基)苯并咪唑、L-丙氨酸、小牛胸腺DNA(CT-DNA)、溴化乙啶(EB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、抗壞血酸(Vit C)、瓊脂糖凝膠和質(zhì)粒pBR322DNA均為生化試劑，其他試劑為市售分析純.研究配合物與DNA相互作用時，底液Tris-HCl/NaCl緩沖溶液為:10 mmol·L-1Tris+50 mmol·L-1NaCl緩沖液(pH=7.2)，Tris-硼酸(TBE)電泳緩沖液為:4.5×10-2mol·L-1Tris+4.5×10-2mol·L-1H3BO3+1 mol·L-1EDTA(pH=8.3)，CT-DNA 濃度按照文獻(xiàn)［9］方法確定.

供試菌種:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(G+)，枯草桿菌Bacillus subtilis(G+)，沙門氏桿菌Salmonella typhi(G-)，大腸埃希菌 Escherichia coil(G-)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廣東省植物分子育種重點實驗室提供.

1.2 配合物的合成與表征

稱取0.5 mmol丙氨酸溶于5 mL雙蒸水中并用0.5 mmol NaOH中和攪拌得溶液A;將0.5 mmol TBZ溶于20 mL無水乙醇中，加熱攪拌下加入1.0 mL 0.5 mol·L-1Cu(ClO4)2溶液，反應(yīng) 15 min，得溶液B;將以上2種溶液混合，待加熱攪拌回流30 min后冷卻至室溫，過濾，靜置濾液，15 d后析出藍(lán)色晶體.過濾并依次用少量水、乙醇洗滌，空氣中干燥后置于干燥器中保存.通過KBr壓片測定配合物在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜，測定配合物甲醇溶液的電子吸收光譜，以及對配合物進(jìn)行元素分析，從而對配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征.

1.3 抑菌試驗

應(yīng)用試管二倍稀釋法測定配合物最小抑菌濃度(MIC).取10支(10 mL)消毒試管并進(jìn)行編號.首先往10支消毒并已編號的試管(10 mL)中分別加入1.0 mL營養(yǎng)肉湯，然后將1.0 mL待測樣品加入到1號試管內(nèi)，振蕩搖勻后，從1號試管吸取1.0 mL溶液加入到2號試管，再從2號試管吸取1.0 mL溶液加入到3號試管，一直到9號試管，再從9號試管內(nèi)吸取1.0 mL溶液棄去.10號試管不加待測樣品.在10支試管中均加入20 μL菌液，然后將10支試管放入培養(yǎng)箱，在相對濕度＞80%和溫度為37℃條件下培養(yǎng)24 h后取出觀察，并記錄試驗現(xiàn)象.

1.4 配合物與CT-DNA作用

1.4.1 電子吸收光譜測定 以Tris-HCl/NaCl緩沖溶液作空白對照液，測定標(biāo)題配合物在200～400 nm范圍內(nèi)的電子吸收光譜.然后，在恒定配合物濃度為1×10-4mmol·L-1下，依次往空白池和樣品池中加入等體積的CT-DNA溶液，使CT-DNA與配合物的濃度比值不斷增加，室溫下作用6 min后，在相同波長范圍內(nèi)掃描.

1.4.2 熒光光譜測定 以Tris-HCl/NaCl緩沖溶液作溶劑，配制 EB 濃度為4.8 μmol·L-1、CT-DNA 濃度為5.5 μmol·L-1的溶液，放置4 h后測定該體系的熒光強(qiáng)度.然后，保持EB和CT-DNA濃度不變，逐漸增加配合物的濃度，室溫下作用5 min后，在同樣波長范圍內(nèi)掃描.儀器測量參數(shù):激發(fā)波長為525 nm，掃描速度為240 nm·s-1，波長范圍為550～650 nm.

1.4.3 圓二色光譜測定 固定CT-DNA濃度為100 μmol·L-1，逐漸增加配合物濃度，在同樣波長范圍內(nèi)，測定其圓二色(CD)光譜.掃描速度 100 nm·min-1，波長范圍200～320 nm，累計掃描5次.

1.4.4 粘度試驗 恒定溫度為(29.0±0.1)℃，以Tris-HCl/NaCl緩沖溶液作為溶劑，固定CT-DNA濃度為0.2 mmol·L-1，依次增大配合物濃度，并測定溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時間.由公式η=(t-t0)/t0(式中，t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時間，t為含不同濃度配合物的CT-DNA溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間)計算CT-DNA溶液相對粘度(η)，然后以(η/η0)1/3對c配合物/cDNA(η0為未加配合物時CT-DNA溶液的比粘度)作圖.每個樣品溶液至少重復(fù)測定3次，取平均值.

1.5 配合物對pBR322DNA的切割作用

固定pBR322 DNA為200 ng，逐漸增加配合物的濃度及50倍于配合物濃度的還原劑Vit C，然后用Tris-HCl/NaCl緩沖溶液定容至17 μL，28℃下放置2 h后，加入3 μL上樣緩沖液［含0.25%(w)溴酚藍(lán)和50%(w)甘油的水溶液］，在8 g·L-1瓊脂糖凝膠和TBE電泳緩沖液中電泳(100 V)40 min.溴酚藍(lán)作為電泳過程指示劑，Gold View(4～5 μL)作為凝膠著色劑，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相.為了探索配合物切割DNA的作用機(jī)理，在上述相同條件下，先分別將 4 μL 二甲基亞砜(DMSO)、100 μmol·L-12，2，6，6-四甲基 -4- 哌啶酮(TMP)或疊氮鈉(NaN3)與pBR322 DNA混合作用15 min，再加入配合物及Vit C，進(jìn)行電泳和照相.

2 結(jié)果與分析

2.1 配合物表征

配合物 C15H21O8N4CuS2Cl元素分析，實驗值/%:C，33.31;H，3.19;N，11.85;理論值/%:C，33.20;H，3.21;N，11.91.元素分析結(jié)果與理論值基本吻合，表明推測的配合物組成與實際一致.測得配合物甲醇溶液的摩爾電導(dǎo)率為115 S·cm2·mol-1，由此推測配合物為1∶1型電解質(zhì)［10］.

測得配合物紅外光譜 (KBr)，ν/cm-1:3 443(s，br)，3 267(m)，3 059(m)，1 647(vs)，1 391(s)，1 521(w).3 443 cm-1處強(qiáng)的吸收峰歸屬于配位H2O的ν—OH;3 059 cm-1及3 267 cm-1處吸收帶歸屬于—NH2的2個不對稱分裂吸收峰ν—NH，表明L-丙氨酸根的—NH2參與了配位;1 647 cm-1及1 391 cm-1分別歸屬于—COO-的不對稱伸縮振動νasCOO-和對稱伸縮振動，且之間差值:△ν()＞200 cm-1，表明 L-Ala的—COO-為單齒配位基團(tuán)［11］.另外，1 521 cm-1處吸收歸屬于配體 TBZ 的C ═ N伸縮振動.

試驗測得配合物電子吸收光譜，λ/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):243(15 241)，301(19 798)，633(132).在配合物甲醇溶液的電子光譜中，紫外區(qū)243 nm和251 nm處2個強(qiáng)吸收峰均歸屬于配體TBZ的π→π*躍遷.與自由配體相比，最大吸收峰的位置未發(fā)生明顯改變，但強(qiáng)度有所減弱，歸因于TBZ上的氮原子配位后引起配體芳環(huán)上電子云密度的降低.另外，633 nm處弱而寬的吸收峰歸屬于中心Cu(Ⅱ)離子的d→d躍遷，并由此推測配合物在甲醇溶液中具有變形四方錐結(jié)構(gòu).

綜合上述分析可以推測，標(biāo)題配合物分子式為:［Cu(TBZ)(L-Ala)(H2O)］ClO4.

2.2 配合物抑菌活性

將化合物配制成質(zhì)量濃度為1 024及640 μg·mL-1的原液，通過試管二倍稀釋法形成濃度梯度.細(xì)菌最終接種量為5×106CFU·mL-1，37℃條件下培養(yǎng)24 h，測得Cu(ClO4)2、TBZ和配合物抑制細(xì)菌最低質(zhì)量濃度(MIC)，結(jié)果見表1.

表1 化合物抑制細(xì)菌生長的最低質(zhì)量濃度(MIC)Tab.1 Minimal inhibitory concentrations(MIC)of the compounds for the assayed bacteria μg·mL-1

表1中試驗數(shù)據(jù)表明:對于所有4種菌種，配合物所需最低抑菌濃度均比Cu(ClO4)2和TBZ的低，表明配合物抗菌活性高于Cu(ClO4)2及TBZ，這可能主要歸因于配合物分子中中心金屬銅(Ⅱ)離子與配體之間的協(xié)同作用，與文獻(xiàn)［4］報道的結(jié)論一致.

2.3 配合物與CT-DNA的相互作用

為了初步探索配合物抑菌作用機(jī)理，本文通過光譜學(xué)、流體力學(xué)等方法研究了配合物與DNA的作用.

2.3.1 電子吸收光譜 電子吸收光譜是研究配合物與DNA作用的最常用方法之一.在210～400 nm范圍內(nèi)，標(biāo)題配合物均出現(xiàn)了2個吸收峰，歸屬于2-(4'-噻唑基)苯并咪唑的π→π*躍遷吸收.配合物與CT-DNA相互作用的吸收光譜滴定曲線如圖2所示.圖2表明，配合物在210～400 nm波長范圍內(nèi)吸收峰強(qiáng)度隨著CT-DNA濃度增加而發(fā)生明顯的減色效應(yīng)，說明配合物與CT-DNA之間可能發(fā)生了插入作用，并根據(jù)以下方程式可定量求得兩者間的結(jié)合常數(shù) Kb［12］:

其中，cDNA為 CT-DNA的濃度，εa為配合物的表觀摩爾吸光系數(shù)，εf和εb分別為自由配合物的摩爾吸光系數(shù)和完全結(jié)合后的配合物的摩爾吸光系數(shù).以cDNA/(εf-εa)對 cDNA作圖(圖 2 中插圖)，由斜率與截距的比值獲得結(jié)合常數(shù) Kb=1.439×105L·mol-1，此值比經(jīng)典插入試劑溴乙錠(EB)的Kb值(1.4 ×106L·mol-1)［8］小1 個數(shù)量級，表明標(biāo)題配合物對DNA的插入作用較弱.

圖2 配合物在不同CT-DNA濃度下的電子吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectra of the complex upon addition of CTDNA

2.3.2 熒光光譜 熒光光譜被廣泛地應(yīng)用于研究配合物與DNA之間的相互作用.測得配合物與CTDNA作用的溴化乙錠(EB)熒光光譜如圖3所示.

圖3 配合物對EB-DNA體系熒光光譜的影響Fig.3 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EBDNA system

由圖3可以看出，隨著配合物濃度增加，EB-CTDNA體系的熒光強(qiáng)度被顯著地淬滅，表明配合物分子將EB從EB-CT-DNA復(fù)合物中擠出，由此推測配合物可能對CT-DNA發(fā)生了插入作用.由以上滴定試驗，應(yīng)用經(jīng)典Stern-Volmer方程可以求得配合物取代EB而與CT-DNA作用的淬滅常數(shù)Ksq［12］:

其中，I0和I分別為未滴加配合物和滴加配合物時EB-CT-DNA體系的熒光強(qiáng)度，r為配合物與CT-DNA的濃度比.將I0/I對r作圖獲得一條直線(圖3中插圖)，其斜率為Ksq值，即0.088 43.此值比文獻(xiàn)報道的配合物的Ksq值［13］小得多，表明配合物對CT-DNA只有較弱的插入作用，與以上電子吸收光譜研究結(jié)果一致.

2.3.3 圓二色光譜 DNA是手性大分子，CD光譜中有2個特征的吸收峰，即275 nm附近的正峰和245 nm附近的負(fù)峰.當(dāng)配合物與DNA作用，尤其是插入到DNA堿基對之間時，DNA構(gòu)象會發(fā)生變化，從而引起DNA的CD光譜發(fā)生變化［14］.因此，CD光譜是研究配合物與DNA相互作用的重要方法.標(biāo)題配合物與CT-DNA相互作用的CD光譜如圖4所示.

圖4 配合物對CT-DNA圓二色光譜的影響Fig.4 Effects of the complex on CD spectra of CT-DNA

由圖4可以看出，CT-DNA的正、負(fù)CD峰均隨著配合物濃度增大而減弱，表明配合物與CT-DNA之間發(fā)生了作用，并且這種作用可能與配合物對CTDNA的插入作用有關(guān).

2.3.4 粘度測定 粘度測定被認(rèn)為是在缺乏晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)情況下確定配合物與DNA作用模式的重要手段之一［15］.當(dāng)配合物以靜電、溝面結(jié)合等非插入方式與DNA作用時，DNA溶液的粘度無明顯變化;以部分插入方式與DNA作用時，會導(dǎo)致DNA雙螺旋扭結(jié)，DNA溶液的粘度降低;而以插入方式與DNA作用時，會導(dǎo)致DNA雙螺旋伸長，DNA溶液的粘度增加.配合物對CT-DNA相對比粘度的影響如圖5所示.

圖5 配合物對CT-DNA相對比粘度的影響Fig.5 Effects of the complex on the relative viscosity of CT-DNA

結(jié)果表明，隨著配合物濃度增大，CT-DNA溶液的相對比粘度增加，由此推測配合物以插入方式與CT-DNA作用［15］，與上述光譜方法得出的結(jié)論一致.

2.4 配合物對pBR322 DNA的切割作用

瓊脂糖凝膠電泳是研究配合物對DNA切割作用的重要方法.pBR322 DNA有3種構(gòu)型，即共價閉環(huán)超螺旋型(Ⅰ型)、缺刻環(huán)形(Ⅱ型)以及線型(Ⅲ型).這3種pBR322 DNA構(gòu)型在電泳過程中具有不同的遷移速率，通常Ⅰ型結(jié)構(gòu)最為緊密，遷移速率最大，Ⅲ型次之，而Ⅱ型結(jié)構(gòu)比較松散，遷移速率最小.28℃條件下，測得配合物對pBR322 DNA的切割作用如圖6所示.

圖6 配合物切割pBR322 DNA的凝膠電泳圖Fig.6 Agarose gel eletrophoresis for the cleavage of pBR322 DNA by the complex in the presence of Vit C

圖6表明，抗壞血酸、配合物或在抗壞血酸存在下，Cu(ClO4)2及TBZ對pBR322 DNA均未顯示出明顯的切割作用，只有配合物與抗壞血酸共存條件下才能將pBR322 DNA的超螺旋構(gòu)型切割成缺刻構(gòu)型.

為了進(jìn)一步揭示配合物切割DNA的作用機(jī)制，在活性氧·OH自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)及單線態(tài)氧1O2清除劑2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TMP)或疊氮鈉(NaN3)存在下，研究了配合物對pBR322 DNA的切割作用(圖7).

圖7 加入抑制劑后配合物切割pBR322 DNA的凝膠電泳圖Fig.7 Cleavage of pBR322 DNA in the presence of the complex and inhibitor DMSO，TMP，or NaN3

由圖7可見，在加入DMSO(第3泳道)、TMP(第4泳道)或 NaN3(第 5泳道)后，配合物對pBR322 DNA的切割能力減弱，即 DMSO、TMP或NaN3對配合物切割DNA有抑制作用.由此推測配合物對pBR322 DNA的切割作用可能與羥基自由基·OH，單線態(tài)氧1O2或者單線態(tài)氧1O2類似物有關(guān)［16］.

3 討論與結(jié)論

本文合成和表征了新的三元配合物:［Cu(TBZ)(L-Ala)(H2O)］ClO4，并研究了該配合物的抑菌活性及與DNA的作用.該配合物分子與文獻(xiàn)［8］報道的配合物［Cu(phen)(L-Thr)(H2O)］(ClO4)類似，具有變形四方錐配位結(jié)構(gòu)，并以插入方式與DNA作用.但與［Cu(phen)(L-Thr)(H2O)］(ClO4)不同的是，在Vit C存在下，該配合物切割DNA既與羥基自由基·OH有關(guān)，又可能與單線態(tài)氧1O2或其類似物有關(guān).與配體TBZ及銅(Ⅱ)鹽Cu(ClO4)2相比，該配合物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌和大腸埃希菌等具有良好的抑制作用，這既與中心銅(Ⅱ)離子與芳香雜環(huán)配體TBZ的π-協(xié)同作用有關(guān)，又可能依賴于藥物分子中插入了L-丙氨酸，因為L-α-氨基酸配體能夠增強(qiáng)藥物分子對生物細(xì)胞膜的滲透作用、減弱其在生物體內(nèi)毒副性、提高水溶性而增強(qiáng)細(xì)胞對藥物吸收效果等，從而可進(jìn)一步提高配合物的抗菌活性.另外，該配合物抗菌活性可能與配合物對生物體內(nèi)DNA的抑制作用有關(guān)，有關(guān)詳細(xì)作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究.

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