胡國(guó)元，胡 堅(jiān)，李超影，楊春雷，袁 軍，余 君，楊錦鵬

(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2. 湖北省煙草科研所，湖北 武漢 430030)

0 引 言

煙草黑脛病、赤星病等真菌病害嚴(yán)重影響了煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量，采用化學(xué)農(nóng)藥控制煙草病害仍然很普遍.然而，化學(xué)農(nóng)藥的殘留對(duì)生物和環(huán)境存在著潛在的威脅，而且它們的使用導(dǎo)致病原菌的抗性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重.為此，開發(fā)化學(xué)農(nóng)藥替代品的研究日益引起人們的重視[1].

殼寡糖是由2～10個(gè)2-氨基葡萄糖通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的一種寡糖[2].殼寡糖為殼聚糖的衍生物，殼聚糖及其衍生物屬含氮高分子聚合物，在土壤中易被微生物分解，其終產(chǎn)物可被植物吸收[3].利用殼寡糖控制病原真菌的研究已有大量報(bào)道[1-7].應(yīng)用殼寡糖抑制煙草真菌病原菌的報(bào)道較少.本研究旨在探索殼寡糖對(duì)煙草赤星病病原菌的抑制效果.通過(guò)測(cè)定不同濃度的殼寡糖對(duì)煙草赤星病病原菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢的抑制作用及殼寡糖抑菌作用的熱穩(wěn)定性和pH值對(duì)殼寡糖抑菌作用的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

1.1.1 殼寡糖 殼寡糖由大連中科格萊克生物科技有限公司提供，批號(hào)MP-91，聚合度為2～10，平均分子量≤1 000.

1.1.2 菌種來(lái)源 鏈格孢菌[Alternariaalternata(Fr.)Keissler] 由湖北省煙草科研所提供的赤星病病原菌.

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖瓊脂(potato sucrose agar, PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉18 g，自然狀態(tài)pH值.121 ℃下濕熱滅菌20 min備用.

1.2 方法

1.2.1 抑制菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn) 稱取一定量的殼寡糖粉末，用無(wú)菌水溶解后得到質(zhì)量濃度為200 g/L的原液，吸取一定量的殼寡糖原液，注入到定量的PDA培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中的殼寡糖質(zhì)量濃度分別為10,12,15 g/L，對(duì)照組添加等量的無(wú)菌水.赤星病病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用打孔器獲得生長(zhǎng)旺盛的菌餅(Φ7.6 mm)，將菌餅接種到裝有不同質(zhì)量濃度殼寡糖PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(Φ90 mm)中央，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各重復(fù)5個(gè)培養(yǎng)皿.28 ℃培養(yǎng)48 h后開始采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑取平均值記錄，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[2,6-7].

菌絲生長(zhǎng)抑制率=

1.2.2 孢子萌發(fā)試驗(yàn) 用無(wú)菌水將在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后赤星病病原菌的孢子洗脫下來(lái)并振蕩搖勻，通過(guò)二倍稀釋法使其在顯微鏡低倍鏡(×40)視野中保持個(gè)數(shù)為100左右.所需的不同質(zhì)量濃度殼寡糖溶液采用1.2.1中殼寡糖原液稀釋獲得.采用載玻片懸滴法，將孢子懸浮液10 μL滴在凹玻片上，實(shí)驗(yàn)組殼寡糖質(zhì)量濃度分別為0.5,1,2.5,5,10 g/L.將不同濃度殼寡糖溶液取10 μL溶液滴加在孢子懸浮液中，對(duì)照組取等量的蒸餾水作同樣處理.28 ℃培養(yǎng)5 h后觀察孢子萌發(fā)情況，每組包含三個(gè)重復(fù)，并計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率[3].

1.2.3 產(chǎn)孢量試驗(yàn) 用無(wú)菌水將在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后赤星病病原菌的孢子洗脫下來(lái)，通過(guò)二倍稀釋法使10 μL的孢子懸液在顯微鏡低倍鏡(×40)視野中保持個(gè)數(shù)為100左右，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每個(gè)培養(yǎng)皿中孢子總數(shù)，實(shí)驗(yàn)組殼寡糖質(zhì)量濃度分別為5，10 g/L.計(jì)算產(chǎn)孢量的抑制率[7].

1.2.4 殼寡糖熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 將配制好的殼寡糖原液(200 g/L)分別置于烘箱并調(diào)節(jié)溫度為40，50，60，70，80 ℃中處理20 min[2]，然后利用不同溫度處理后的殼寡糖原液按方法1.2.1制備裝有殼寡糖質(zhì)量濃度為15 g/L的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，之后操作方法同1.2.1.

1.2.5 殼寡糖pH值穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取一定量配制好的殼寡糖原液并分別添加到四組試驗(yàn)組當(dāng)中，在培養(yǎng)基固化前調(diào)節(jié)四組試驗(yàn)組pH值分別為4,5,6,7 .相應(yīng)四組對(duì)照組加入等量的無(wú)菌水，并在培養(yǎng)基固化前調(diào)節(jié)其pH值為4,5,6,7之后操作方法同1.2.1，實(shí)驗(yàn)組殼寡糖溶液質(zhì)量濃度為15 g/L[2].

2 結(jié)果與討論

2.1 殼寡糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由圖1，圖2可以看出，隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的提高，對(duì)赤星病病原菌菌絲的抑制作用也在提高.48 h殼寡糖質(zhì)量濃度10 g/L時(shí)，對(duì)赤星病原菌菌絲的抑制率達(dá)到了89.36%.當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度達(dá)到15 g/L時(shí)，對(duì)赤星病原菌菌絲的抑制率則達(dá)到了94.74%以上.隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，殼寡糖對(duì)赤星病原菌菌絲的抑制率略有下降.

2.2 殼寡糖對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

由表1可知，殼寡糖質(zhì)量濃度為2.5 g/L 以上時(shí)對(duì)赤星病病原菌孢子萌發(fā)抑制率均在100%，即使質(zhì)量濃度降低至0.5 g/L，其抑制率也可以達(dá)到95.36%.從殼寡糖對(duì)赤星病病原菌孢子萌發(fā)的抑制來(lái)看，所需的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制的質(zhì)量濃度，其可能的原因是孢子萌發(fā)試驗(yàn)中孢子量少，每個(gè)孢子充分接觸殼寡糖，降低了抑制萌發(fā)所需要的質(zhì)量濃度.

圖1 不同質(zhì)量濃度殼寡糖對(duì)赤星病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of oligochi-tosan on mycelial growth of Alternaria alternata

圖2 不同濃度殼寡糖對(duì)赤星病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響(144 h)Fig.2 Effects of different concentrations of oligochito-san on mycelial growth of Alternaria alternata in 144 h注： 1、2、3中殼寡糖濃度分別為10 g/L、12 g/L、15 g/L.1、2、3中左為試驗(yàn)組，右為對(duì)照組.

濃度/(g/L)1052.510.5抑制率/%10010010099.2195.36

2.3 殼寡糖對(duì)產(chǎn)孢量的抑制作用

如表2所示，質(zhì)量濃度為5和10 g/L的殼寡糖溶液處理赤星病病原菌144 h產(chǎn)孢量的抑制率分別為53.1%和69.7%，低于對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率.

表2 不同質(zhì)量濃度殼寡糖對(duì)赤星病病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 2 Effects of different concentrations of oligochito-san on spore production of Alternaria alternata

2.4 殼寡糖熱穩(wěn)定性

如圖3，圖4所示，在48 h，5組殼寡糖質(zhì)量溶液對(duì)赤星病病原菌的抑制率分別為90.46%，89.19%，91.88%，92.39%，92.74%.在144 h，5組殼寡糖溶液對(duì)赤星病病原菌菌絲的抑制率分別為68.13%，68.05%，65.52%，69.02%，70.13%.比較各組抑制率的大小可以得出殼寡糖的抑菌作用具有良好的熱穩(wěn)定性.該結(jié)果與徐俊光(2007)[2]報(bào)道不同溫度處理不同質(zhì)量濃度殼寡糖質(zhì)量溶液對(duì)其抑菌活性沒(méi)有顯著性影響的的結(jié)果一致.

圖3 不同溫度處理后的殼寡糖對(duì)赤星病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different temperature of oligoc-hitosan on mycelial growth of Alternaria alternata

圖4 不同溫度處理后的殼寡糖對(duì)赤星病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響(144h)Fig.4 Effects of different temperature of oligochito-san on mycelial growth of Alternaria alternate in 144 h注： 1、2、3、4、5中殼寡糖處理溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃.1、2、3、4、5中左圖為試驗(yàn)組，右圖為對(duì)照組.

2.5 殼寡糖pH值穩(wěn)定性

由圖5，圖6可知，pH值對(duì)殼寡糖溶液對(duì)煙草赤星病病原菌的抑菌率影響較大.在48 h，培養(yǎng)基pH值為4, 5, 6, 7的實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的抑制率分別為100%，98%，85.05%，60.26%.在120 h，培養(yǎng)基pH值為4, 5, 6, 7的實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的抑制率分別為100%，91.24%，68.78%，46.24%.然而，徐俊光(2007)[2]報(bào)道pH值對(duì)殼寡糖抑菌活性的影響因菌而異.這一結(jié)果暗示著殼寡糖對(duì)不同類別的菌可能存在不同的抑菌機(jī)理，并且說(shuō)明在使用殼寡糖生物農(nóng)藥時(shí)要注意溶液酸堿性的影響.

圖5 不同pH值殼寡糖對(duì)煙草病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different pH of oligochitosan on mycelial growth of Alternaria alternata

圖6 不同pH值殼寡糖對(duì)煙草病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響(120 h)Fig.6 Effects of different pH of oligochitosan on mycelial growth of Alternaria alternata in 120 h注： 1、2、3、4中培養(yǎng)基pH值分別4、5、6、7. 1、2、3、4中左圖為試驗(yàn)組，右圖為對(duì)照組.

3 結(jié) 語(yǔ)

a. 殼寡糖對(duì)煙草赤星病病原菌具有較好的抑制作用.

b. 質(zhì)量濃度為10 g/L的殼寡糖在48 h時(shí)，對(duì)煙草赤星病病原菌菌絲的抑制率達(dá)到了89.36%.當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度達(dá)到15 g/L時(shí)，對(duì)赤星病原菌菌絲的抑制率則達(dá)到了94.74%以上.

c. 殼寡糖質(zhì)量濃度為2.5 g/L 以上時(shí)對(duì)煙草赤星病病原菌孢子萌發(fā)抑制率均在100%，所需的殼寡糖質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制的濃度.

d. 質(zhì)量濃度為5和10 g/L的殼寡糖溶液在144 h時(shí)，對(duì)煙草赤星病病原菌產(chǎn)孢量的抑制率分別為53.1%和69.7%，低于對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率.

e. 殼寡糖對(duì)煙草赤星病病原菌菌絲的抑制作用對(duì)于熱處理具有良好的穩(wěn)定性.

f. 質(zhì)量濃度為15 g/L的殼寡糖PDA培養(yǎng)基pH值為4, 5, 6, 7在48 h時(shí)，對(duì)煙草赤星病病原菌菌絲的的抑制率分別為100%，98%，85.05%，60.26%，pH值對(duì)殼寡糖溶液的抑菌率影響較大.

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