劉建成 馬貴軍 蔣粒薪

棉籽粕（cottonseed meal,CSM）是棉籽經(jīng)脫殼、加熱、壓扁成薄片用溶劑浸出油后，所剩余的副產(chǎn)品。棉籽粕中含粗蛋白40%以上，還含有豐富的賴氨酸、蛋氨酸，是畜禽飼料中非常有價(jià)值的一種原料。我國是一個(gè)產(chǎn)棉大國，每年有1100萬噸以上的棉籽，年可產(chǎn)棉籽餅粕600萬噸以上，資源量全球第一。棉籽餅粕是一種極具開發(fā)潛力的植物蛋白飼料資源，但是棉籽餅粕中含有有毒物質(zhì)游離棉酚，會對動物的生產(chǎn)、發(fā)育和繁殖等方面產(chǎn)生不良影響，從而限制了棉籽餅粕安全而有效地用作動物蛋白飼料，部分地區(qū)將其作肥料，造成飼料資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

棉籽餅粕的主要脫毒方法有物理法 (熱處理、機(jī)械壓榨、有機(jī)溶劑浸提)、化學(xué)法(硫酸亞鐵、氫氧化鈣)以及微生物發(fā)酵法。最具有應(yīng)用前景的是微生物發(fā)酵法，該法不但能脫除棉籽餅粕中的游離棉酚，而且還可以提高棉籽餅粕的蛋白質(zhì)含量，并且發(fā)酵底物中存留許多酶類、維生素、氨基酸以及一些促生長因子，從而大大改善棉粕的營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，提高棉粕利用率。

本研究嘗試從對動物有益的酵母菌屬、芽孢桿菌屬及乳酸菌屬中篩選出能高效降解棉粕中游離棉酚的菌株，對棉粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。降低棉粕中游離棉酚含量，并產(chǎn)生大量益生菌、乳酸、生長因子，提高動物免疫力，改善棉粕的營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，提高棉粕利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：芽孢桿菌屬2株：B－1、B－2。乳酸菌屬4株：L－1、L－2、L－3、L－4。酵母菌屬 4 株：Y－1、Y－2、Y－3、Y－4。以上菌株均購自中國工業(yè)微生物菌種保存中心（CICC）。

原料：棉粕購自新疆新光油脂廠。

1.2 培養(yǎng)基

單菌培養(yǎng)基（g/l）：糖蜜 40、蛋白胨 10、葡萄糖 1、磷酸氫二鉀 0.5、硫酸鎂 0.2，pH值7.0～7.2，121℃高壓滅菌25 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/kg）：棉籽粕 950、麩皮 45、天康酶制劑5、糖蜜10、水700。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫酚細(xì)菌菌株的初篩

以棉籽仁（含游離棉酚7012.98 mg/kg）作為培養(yǎng)基唯一營養(yǎng)物，配制棉酚含量為200 mg/kg的初始篩選平板。將6株細(xì)菌的單菌培養(yǎng)液稀釋后涂于初始篩選平板上，在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)觀察。

1.3.2 脫酚酵母菌菌株的初篩

以固體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制棉酚含量為200 mg/kg的初始篩選培養(yǎng)基。按2%的接種量，將培養(yǎng)后的不同酵母菌液接種于滅菌后的初始篩選培養(yǎng)基中，充分混勻后于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，測定發(fā)酵后培養(yǎng)基中菌含量。

1.3.3 滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵

將固體發(fā)酵培養(yǎng)基各成分充分混勻后，裝入100 g/500 ml在三角瓶中，于121℃高壓滅菌25 min。冷卻至室溫后，按2%的接種量，將培養(yǎng)后的單菌液稀釋10倍后接種，混勻后于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)發(fā)酵。

1.3.4 不滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵

按2%的接種量，先將菌種、糖蜜和水充分混勻，再與混勻后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合，充分?jǐn)嚢韬笱b于500 g取樣袋中，密封后放于生化培養(yǎng)箱中30℃恒溫發(fā)酵。

1.4 測定方法

細(xì)菌總數(shù)的測定：飼用細(xì)菌總數(shù)的測定采用GB13093—91方法；

酵母菌總數(shù)的測定采用麥芽汁平板進(jìn)行稀釋涂平板計(jì)數(shù)；

游離棉酚的測定采用苯胺法（GB13086—91）。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫酚細(xì)菌菌株的初篩結(jié)果(見表1)

表1 細(xì)菌菌株初始平板篩選試驗(yàn)結(jié)果

從表1可知，菌株B-1和B-2在營養(yǎng)物質(zhì)單一而棉酚含量較高的棉仁汁培養(yǎng)基平板上長勢良好。說明其生長和耐酚能力較強(qiáng)，并有可能利用棉酚作為營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長代謝，從而起到降解棉酚的作用。而乳酸菌類在此條件下不具有這一特點(diǎn)。

2.2 脫酚酵母菌菌株的初篩結(jié)果(見表2)

表2 酵母菌菌株初始篩選試驗(yàn)結(jié)果

從表2可知，所選4株酵母菌均能在初始篩選固體培養(yǎng)基上長勢良好。其中菌株Y-4長勢最好，平均每克培養(yǎng)基中含菌量可達(dá)10億個(gè)。

2.3 單個(gè)細(xì)菌在滅菌條件下生長情況及脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果(見表3)

由以上結(jié)果，我們可以看出乳酸菌類在滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上生長差，可能是因?yàn)槠鋵I養(yǎng)要求較高，而棉仁汁培養(yǎng)基中不僅營養(yǎng)物單一，還含有較高的游離棉酚。并且高溫滅菌過程可能會對棉粕中的一些營養(yǎng)物質(zhì)造成了破壞，不利于乳酸菌的生長，從而也導(dǎo)致乳酸菌類對棉酚的脫除效果不好。而芽孢桿菌屬的兩株菌B-1和B-2在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上長勢良好，說明其對營養(yǎng)要求低，生長能力較強(qiáng)。其中菌株B-2對棉粕中游離棉酚有較強(qiáng)的脫除效果，其脫酚率達(dá)到35%。

表3 細(xì)菌單菌固態(tài)發(fā)酵脫酚率的測定結(jié)果

2.4 單個(gè)酵母菌在滅菌條件下生長情況及脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果(見表4)

表4 酵母菌單菌固態(tài)發(fā)酵生長情況及脫酚率的測定結(jié)果

從以上4株酵母菌在滅菌條件下脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，4株酵母菌中菌株Y-4的脫酚率最高，為41.4%，其次是菌株Y-3為22.4%，菌株Y-1的脫酚率為15.9%，而菌株Y-2只有5.0%。分析原因可能是因?yàn)?株酵母菌中Y-4和Y-3在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上長勢更好，其活菌總數(shù)均可達(dá)到108cfu/g，從而增強(qiáng)了菌體細(xì)胞對棉酚的降解。

2.5 單個(gè)細(xì)菌在不滅菌條件下生長情況及脫酚率的測定試驗(yàn)結(jié)果(見表5)

表5 不滅菌條件下6株細(xì)菌生長情況及固態(tài)發(fā)酵脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果

6株細(xì)菌在不滅菌條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，均對培養(yǎng)基中游離棉酚具有一定的脫除作用。其中乳酸菌屬的菌株在物料不滅菌條件下生長情況和脫酚率都比滅菌條件下好?？赡苁且?yàn)槲锪衔唇?jīng)高溫滅菌，消除了高壓滅菌對物料中營養(yǎng)物質(zhì)的影響，促進(jìn)了這些菌的生長。另一方面物料中自然菌的繁殖對目標(biāo)菌的生長和游離棉酚的降解也可能起到了一定的促進(jìn)作用。而菌株B-2在物料不滅菌條件下脫酚率也比其他菌株好，達(dá)到了38.2%。因此確定主要脫酚細(xì)菌菌株為：B-2。

2.6 單個(gè)酵母菌在不滅菌條件下生長情況及脫酚率的測定試驗(yàn)結(jié)果(見表6)

表6 不滅菌條件下4株酵母菌固態(tài)發(fā)酵脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果

由以上結(jié)果可知菌株Y-4在物料是否滅菌上的脫酚率差異不顯著，說明菌株Y-4受外界影響較小，脫酚能力比較穩(wěn)定，并且菌株Y-4及Y-3的脫酚率始終優(yōu)于其他兩株菌。菌株Y-2及Y-1在未滅菌物料上的脫酚率明顯高于滅菌物料上的脫酚率，這可能是因?yàn)槲礈缇锪现械淖匀痪纳L對這兩株菌的脫酚效果具有一定的促進(jìn)作用。從活細(xì)胞數(shù)上可以看出菌株Y-4和Y-3長勢略優(yōu)于其他兩株菌，與前期試驗(yàn)結(jié)果一致。在游離棉酚的測定結(jié)果中，菌株Y-4脫酚能力最強(qiáng)，脫酚率最高為47.5%，Y-3次之為44.6%。因此，確定最佳脫酚酵母菌為Y-4。

3 討論

3.1 脫酚菌株的篩選

為了能達(dá)到通過微生物發(fā)酵降解棉粕中游離棉酚的目的并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，本試驗(yàn)參考了前人研究的成果并結(jié)合了本公司現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特點(diǎn)，將菌種篩選范圍縮小在芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌三個(gè)菌屬的十株菌中，具有一定的局限性。在棉粕原料、棉地土壤等其他環(huán)境中可能存在更為有效地降解棉粕中游離棉酚的菌種資源，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 高壓滅菌的作用

為了消除雜菌的影響，有效的測定所選菌株對棉粕中游離棉酚的降解作用，試驗(yàn)先期采取了對固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌處理。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌處理后，其所含游離棉酚含量明顯降低。這和施安輝、賈曉鋒等得出的結(jié)果一致。因高溫高壓有助于使游離棉酚變成結(jié)合棉酚，對微生物脫酚能力的篩選不利，并且在工業(yè)化大生產(chǎn)中對大宗原料進(jìn)行高溫高壓滅菌處理難度很大、成本高，難以實(shí)現(xiàn)。于是又研究了對固體發(fā)酵培養(yǎng)基不滅菌處理，綜合了滅菌和不滅菌兩種方式下不同菌株的脫酚效果，從中篩選出了能高效降解棉粕中游離棉酚的有效菌種B-2和Y-4。

3.3 菌種的組合

試驗(yàn)研究了3個(gè)不同微生物屬中的10株不同菌在單菌發(fā)酵過程中對棉粕中游離棉酚的降解情況。為了彌補(bǔ)單個(gè)菌種的不足，目前大多數(shù)研究者都傾向于進(jìn)行復(fù)合菌發(fā)酵。如張文舉等利用熱帶假絲酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8對棉籽餅底物進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，可極顯著降低棉籽餅底物中游離棉酚含量，脫毒率為91.64%。夏新成等利用復(fù)合發(fā)酵(兩株酵母和一株霉菌)可顯著降低棉籽粕底物中游離棉酚含量，最高降解率達(dá)86.24%。因此有必要對本試驗(yàn)所篩選出來的菌種進(jìn)行不同比例的復(fù)配，進(jìn)一步研究在不同菌種組合條件下，復(fù)合菌的脫酚效果，以提高脫酚率。

4 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)室保藏的可用于動物飼料生產(chǎn)的10株菌中篩選出了2株能有效降解棉粕中游離棉酚的菌株Y-4和B-2。通過在滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，確定了各個(gè)菌株的脫酚率，其中菌株Y-4和B-2脫酚率最高分別為41.4%和35%。為了實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，進(jìn)行了不滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明各個(gè)菌株均對棉粕中的游離棉酚具有一定的降解作用，其中菌株Y-4和B-2的脫酚率較高，分別為47.5%和38.2%。

該研究結(jié)果對微生物發(fā)酵降解棉粕中游離棉酚提供了高效菌株，也為進(jìn)一步探索菌株Y-4、Y-3及B-2發(fā)酵脫酚條件奠定了基礎(chǔ)，對于微生物發(fā)酵降解棉粕中游離棉酚的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

18篇，刊略，需者可函索）