魯琳琳 白曉紅 呂 睿

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖中心(300052)

胚胎發(fā)育到囊胚階段能否從透明帶中孵出是決定胚胎能否種植的先決條件，孵出困難可能是胚胎種植失敗的原因之一［1］。Cohen等［2］發(fā)現(xiàn)有些胚胎的透明帶均勻一致，而有些則厚薄不均，他建議將透明帶厚度(ZPT)作為評價早期胚胎質量的參數(shù)。透明帶厚度變量(ZPTV)最早由 Cohen提出，他將ZPTV定義為透明帶厚度最大值與平均值的差值與透明帶平均厚度的百分比［2］。有報道認為相對于ZPT，ZPTV與妊娠結局有更好的相關性［3］。本文觀察分析在體外受精－胚胎移植(IVF－ET)周期中新鮮移植胚胎ZPT及ZPTV，以評價早期胚胎ZPT和ZPTV與治療結局的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2011年3～4月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖中心對51對夫婦施行IVF－ET 51個周期，共移植119枚新鮮胚胎。其中IVF 28個周期，65枚胚胎;卵胞漿內單精子注射(ICSI)23個周期，54枚胚胎。女方年齡32.04±4.45歲;原發(fā)不孕32個周期，繼發(fā)不孕19個周期。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器及試劑 Saturn Active激光系統(tǒng)附帶圖像采集及測量軟件(RI，英國);Forma CO2培養(yǎng)箱(Forma，美國);Olympus解剖鏡及倒置顯微鏡(O-lympus，日本);Vitrolife胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)(Vitrolife，瑞典)。

1.2.2 超排卵方案 采用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH－a)/促性腺激素(Gn)/人絨毛膜促性腺激素(hCG)長方案或超長方案。長方案一般于前一月經(jīng)周期的黃體中期使用GnRH－a，7～10d后行陰道B超檢查并測血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成激素(LH)和雌二醇(E2)評價垂體降調情況，于促排卵周期第3～5d應用Gn，陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，并測血E2、LH、孕酮(P)直至注射hCG日。hCG注射36h后取卵。對于多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥患者，采用超長方案［4］。

1.2.3 實驗室操作 取卵當日患者丈夫取精，精液常規(guī)分析并進行精子處理。常規(guī)IVF在取卵后將卵丘－放射冠－卵母細胞復合物培養(yǎng)4～6h后受精。ICSI操作按文獻［5］進行。受精后16～18h觀察卵子受精情況，觀察到兩個極體并見兩個清楚原核表明正常受精。受精后培養(yǎng)至24～48h觀察卵裂情況。

1.2.4 胚胎評分及胚胎移植 取卵后42～66h根據(jù)胚胎形態(tài)學參數(shù)對早期胚胎進行分級。Ⅰ級:卵裂球形狀規(guī)則、大小均勻，胞質均勻清晰，無碎片或者碎片少于10%;Ⅱ級:胚胎卵裂球大小略不均，形狀略不規(guī)則，碎片含量10% ～25%;Ⅲ級:卵裂球大小明顯不均或形狀明顯不規(guī)則，碎片含量達25% ～50%;Ⅳ級:卵裂球大小嚴重不均，碎片超過50%;Ⅴ級:延遲受精或補救受精形成的胚胎。Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優(yōu)質胚胎，從中選擇2～3枚進行胚胎移植(本研究中有4個周期只形成1枚優(yōu)質胚胎而移植1枚)。移植后予黃體支持，并于移植后2周查尿hCG和血β－h(huán)CG，陽性為生化妊娠。移植后4周B超檢查，若見妊娠囊則診斷臨床妊娠。

1.2.5 ZPT、ZPTV的測量 在倒置顯微鏡下利用激光系統(tǒng)附帶測量軟件對每個胚胎透明帶厚度進行測量:取胚胎3、6、9、12四點處自透明帶內側測量至外側，系統(tǒng)自動統(tǒng)計出 ZPTmin、ZPTmax及 ZPTmean。利用所測得數(shù)據(jù)計算ZPTV:ZPTV=［(ZPTmax－ZPTmean)/ZPTmean］× 100［2］。在比較妊娠結局時，分別計算出每個周期移植胚胎的平均ZPT值和ZPTV值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過正態(tài)性檢驗，正態(tài)資料兩組間均數(shù)比較采用t檢驗;多組間均數(shù)比較采用ANOVA，F(xiàn)值有顯著性則進一步行兩兩多重比較;若方差齊采用S－N－K法，方差不齊采用Dunnett's T3法;率的比較采用卡方檢驗。

2 結果

51個周期共移植119枚胚胎，平均每周期移植胚胎數(shù)2.33 ±0.68枚，周期妊娠率為45.10%。

2.1 常規(guī)IVF與ICSI周期ZPT、ZPTV的比較

ZPT和ZPTV值在IVF和ICSI組間差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 ZPT、ZPTV與妊娠結局的關系

妊娠組與未妊娠組對象年齡及ZPT差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);妊娠組ZPTV值大于非妊娠組(P ＜0.001)。見表2。

表1 不同受精方式組胚胎ZPT、ZPTV比較(±s)

表1 不同受精方式組胚胎ZPT、ZPTV比較(±s)

兩組比較P＞0.05

組別 周期數(shù) 年齡(歲) ZPT(μm) ZPTV(%)IVF組28 32.37 ±4.39 17.20 ±2.58 15.27 ±7.59 ICSI組23 32.00 ±4.40 17.81 ±2.63 16.16 ±7.91

表2 妊娠與未妊娠組ZPT、ZPTV比較(±s)

表2 妊娠與未妊娠組ZPT、ZPTV比較(±s)

*與未妊娠組比較P＜0.001

組別 周期數(shù) 年齡(歲) ZPT(μm) ZPTV(%)妊娠組 23 32.78 ±4.53 17.04 ±2.58 19.13 ±7.16*非妊娠組28 31.43 ±4.37 17.83 ±2.67 14.08 ±6.45

2.3 ZPTV與妊娠結局的關系

根據(jù)ZPTV值大小分為兩組，ZPTV≥20%組臨床妊娠率為60.00%，ZPTV＜20%組的臨床妊娠率為38.89%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 ZPT、ZPTV 與年齡的關系

不同年齡組ZPT值和ZPTV值差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表3。

表3 不同年齡組ZPT、ZPTV值比較(±s)

表3 不同年齡組ZPT、ZPTV值比較(±s)

組別 周期數(shù) ZPT(μm) ZPTV(%)＜30歲18 17.30 ±2.96 15.80 ±7.26 30～35歲 15 17.38 ±3.02 15.74 ±8.57＞35歲18 17.85 ±2.35 15.54 ±7.13

2.5 ZPT、ZPTV與FSH基礎水平的關系

ZPTV隨FSH值的升高而減小，差異有統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 不同F(xiàn)SH水平組與ZPT、ZPTV值比較(±s)

表4 不同F(xiàn)SH水平組與ZPT、ZPTV值比較(±s)

*FSH＜8mU/L比較P＜0.05

組別 周期數(shù) 年齡(歲) ZPT(μm) ZPTV(%)FSH≥8U/L 11 32.66 ±4.80 17.93 ±2.88 14.51 ±4.90*FSH ＜8U/L 40 32.42 ±4.40 17.30 ±2.57 17.16 ±7.69

2.6 不同種植率組ZPT、ZPTV值比較

依據(jù)胚胎種植情況分為3組:第1組為非妊娠組(種植率為0);第 2組種植率為1/3、1/2、2/3(33.33% ～66.67%);第3組為全胚種植組(種植率為100%)。各組間ZPT差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，ZPTV第1組與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，第2、3組間差異無統(tǒng)計學意義。見表5。

表5 不同種植率組ZPT和ZPTV值比較(±s)

表5 不同種植率組ZPT和ZPTV值比較(±s)

*與其他兩組比較P＜0.001

組別 周期數(shù) 年齡(歲) ZPT(μm) ZPTV(%)第1 組 28 31.43 ±4.37 17.83 ±2.67 14.08 ±6.45*第2 組 19 32.79 ±5.05 17.18 ±2.53 18.84 ±7.02第3組4 31.75 ±2.99 17.35 ±2.94 20.51 ±8.05

3 討論

迄今為止，大多數(shù)實驗室仍單純以胚胎形態(tài)學參數(shù)評估胚胎種植潛力。但是通過這種方法選擇的優(yōu)質胚胎仍有可能因孵出困難而導致種植失敗。Dokras等［6］觀察體外培養(yǎng)中僅25%的胚胎可以孵出。Cohen等［2］發(fā)現(xiàn)IVF周期種植率下降與胚胎透明帶增厚有關，后續(xù)研究證實透明帶厚度不規(guī)則的胚胎其種植率高于透明帶厚度均勻的胚胎［7］。

本研究顯示，妊娠組移植胚胎的ZPTV值顯著高于非妊娠組(P＜0.001)，且當ZPTV≥20%時妊娠率明顯提高(P ＜0.005)，這與 Palmstierna等［8］的研究結果相似。Cohen等［9］稱透明帶增厚會影響胚胎孵出及種植，但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)妊娠組及非妊娠組間ZPT值有差異。綜上筆者認為ZPTV對妊娠結局有更好的預測價值。本研究還依據(jù)胚胎種植情況進行分組比較，結果發(fā)現(xiàn)胚胎全部種植組與未全部種植組相比ZPTV有增大趨勢，但未顯示統(tǒng)計學意義，需增加數(shù)據(jù)量進一步研究。

文獻［3］報道隨著患者年齡增長，ZPT和ZPTV明顯下降。但本研究并未發(fā)現(xiàn)這一明顯差異。早些年文獻及本研究發(fā)現(xiàn)隨女性年齡增大透明帶逐漸增厚，但近期有研究指出透明帶隨年齡增長變?。?，10］，這一現(xiàn)象是否存在普遍性以及其出現(xiàn)的原因和機制仍待進一步研究。

基礎FSH水平是反應卵巢儲備能力，預測IVF妊娠結局的重要指標之一。當基礎FSH≥10U/L(免疫酶標法)時提示卵巢功能衰退。文獻［11］報道，早卵泡期FSH水平與透明帶厚度具有相關性，至今國內沒有關于基礎FSH與ZPT相關性的研究。本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)基礎FSH≥8U/L時，ZPTV即表現(xiàn)出明顯降低的趨勢(P＜0.05)，而ZPT沒有變化。Schoolcraft等［12］指出基礎 FSH值偏高者 IVF治療預后較差，故認為基礎FSH增高引起ZPTV值減小可能是這些患者妊娠結局不良的原因之一。

近年來輔助孵化在輔助生殖中技術中廣泛應用，尤其對于高齡者、重復著床失敗以及凍融周期解凍胚胎。隨著輔助孵化技術的發(fā)展，激光系統(tǒng)以其快速、準確、安全等特點應用越來越普遍，并且能夠顯著提高胚胎種植率和妊娠率［13］。相對于激光透明帶打孔，激光透明帶削薄不僅可以提高胚胎種植率和妊娠率，同時可減少胚胎損傷。激光透明帶削薄是將胚胎1/4象限的透明帶削薄50% ～80%，可以認為是人為地增加胚胎的ZPTV，胚胎更容易在透明帶薄化處孵出，從而提高妊娠率?？傊?，在臨床工作中可將ZPTV作為傳統(tǒng)形態(tài)學胚胎分級的補充，用來篩選更有種植潛力的胚胎。在形態(tài)學評分的基礎上選擇ZPTV≥20%的胚胎，以提高種植率，改善妊娠結局。

1 Cohen J，Elsner C，Kort H，et al.Impairment process following in vitro fertilization in the human and improvement of implantation by assisting hatching using micromanipulation［J］.Human Reproduction，1990，5(1):7－13.

2 Cohen J，Inge KL，Suzman M，et al.Videocinematography of fresh and cryopreserved embryos:a retrospective analysis of embryonic morphology and implantation［J］.Fertil Steril，1989，51(5):820－827.

3 Gabrielsen A，Bhatnager PR，Petersen K，et al.Influence of zona pellucida thickness of human embryos on clinical pregnancy outcome following in vitro fertilization treatment［J］.J Assist Reprod Genet，2000，17(6):323－328.

4 陳子江.人類生殖與輔助生殖［M］.北京:科學出版社，2005:375.

5 莊廣倫.現(xiàn)代輔助生育技術［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:290－292.

6 Dokras A，Sargent IL，Ross C，et al.The human blastocyst:morphology and human chorionic gonadotrophin secretion in vitro［J］.Human Reproduction，1991，6(8):1143－1151.

7

8 Palmstierna M，Murkes D，Csemiczky G，et al.Zona pellucida thickness variation and occurrence of visible mononucleated blastomers in preembryos are associated with a high pregnancy rate in IVF treatment［J］.J Assist Reprod Genet，1998，15(2):70－75.

9 Cohen J，Alikani M，Trowbridge J，et al.Implantation enhancement by selective assisted hatching using zona drilling of human embryos with poor prognosis［J］.Human Reproduction，1992，7(5):685－691.

10 孫瑩璞、徐瑜，蘇迎春，等.人胚胎透明帶厚度及其變量與體外受精－胚胎移植妊娠結局的關系［J］.生殖醫(yī)學雜志，2004，12(6):349－353.

11 Shiloh H，Lahav－Baratz1 S，Koifman M，et al.The impact of cigarette smoking on zona pellucida thickness of oocytes and embryos prior to transfer into the uterine cavity［J］.Human Reproduction，2004，19(1):157－159.

12 Schoolcraft WB，Schlenker T，Gee M，et al.Assisted hatching in the treatment of poor prognosis in vitro fertilization candidates［J］.Fertil Steril，1994，62(3):551－554.

13 Blake DA，F(xiàn)orsberg AS，Jonhansson BR，et al.Laser zona pellucida thinning－an alternative approach to assisted hatching［J］.Human Reproduction，2001，16(9):1959－1964.