乜照燕 吳海峰 張 娜 郭麗娜 趙素英 甄秀麗 張 軼

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科(石家莊，050011);2.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科

我國育齡夫婦不孕不育的發(fā)病率約為15%，在不孕不育患者中，男性因素占40%，精子質(zhì)量對人類生存繁衍至關(guān)重要。隨著生育年齡的推遲，女方年齡對生育存在的不利影響已成共識，男性生育力是否隨著年齡增加而降低的研究甚少，且存在爭議。精液分析作為男性生育力測定的基本方法，男性精液常規(guī)參數(shù)與年齡關(guān)系已有研究，在眾多與男性不育有關(guān)的因素中，隨著自由基理論的建立和發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對精子的損傷作用，可能是男性不育的原因之一。精子DNA完整性對自然受孕、人工授精、胚胎、胎兒、嬰兒甚至成人的發(fā)育至關(guān)重要，但對精子ROS和精子DNA損傷是否受年齡影響知之甚少。本研究旨在通過對精子ROS和精子DNA損傷與男性年齡的相關(guān)性研究，探討男性年齡與ROS和精子DNA損傷的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

在本科室因女方因素進(jìn)行體外受精－胚胎移植的男性精液標(biāo)本95例，按男方年齡分為3組，年齡＜35歲組40例、35～39歲組34例，≥40歲組21例，年齡34.61±8.45歲，無外傷及遺傳性疾病史，無性功能障礙史，體檢未發(fā)現(xiàn)有明顯睪丸、附睪及輸精管異常。身體健康，無吸煙、酗酒和長期接觸有害物質(zhì)史，無生殖道感染和精索靜脈曲張史等。過氧化物酶染色法排除白細(xì)胞精子癥。

1.2 方法

1.2.1 精液標(biāo)本采集 禁欲3～7 d，采用手淫法取精液，獲取全部精液于干凈容器，立即送精液檢查室，在室溫下精液完全液化后，行精液常規(guī)檢查。每份精液標(biāo)本留取1ml，其中0.5ml精液用于檢測ROS和精子DNA損傷。

1.2.2 精液分析 精液液化后按照文獻(xiàn)［1］的要求行精液常規(guī)手工分析。所有分析由同一名工作人員完成。精子形態(tài)學(xué)分析采用WHO《人類精液及精子－宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》第四版推薦的Diff－Quick快速染色方法進(jìn)行染色，油鏡下采用Kruger的精子形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，每張涂片至少取10個(gè)油鏡視野(×1 000)對精子形態(tài)進(jìn)行評估，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算出每份精液樣本的正常精子形態(tài)百分率。

1.2.3 精子膜脂類過氧化反應(yīng) 精子膜脂類過氧化反應(yīng)的程度以反應(yīng)產(chǎn)物丙二醛 (MDA)的產(chǎn)量表示，MDA測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。0.2ml精液，2ml PBS離心去除精漿后(1 200 r/min，離心5min)按說明書操作，用酶標(biāo)儀(Rayto RT－6100)讀取光密度值。

1.2.4 精子DNA損傷測定 采用精子吖啶橙(AO)染色法［2］，取0.2ml液化精液，用 pH 7.4 0.01mol/L PBS洗滌精子3次，棄去上清液，調(diào)整精子濃度至20×106/ml凃片，晾干，用甲醇固定。用新鮮配制的A0染液染色 5min，水洗，晾干，熒光顯微鏡(OLYMPUX－BX51)觀察(激發(fā)濾光片波長460～490nm)，每個(gè)視野觀察時(shí)間不超過40s。正常精子雙鏈DNA呈綠色，受損傷的精子呈紅色或黃色。每張涂片至少取10個(gè)油鏡視野(×1 000)，計(jì)數(shù)200條精子中綠色(G)、紅色(R)和黃色(Y)精子數(shù)，計(jì)算出DNA損傷精子的百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組精液參數(shù)、精漿ROS水平和精子DNA損傷的比較

≥40歲組的a+b級精子百分率低于＜35歲組(P＜0.05)，精漿ROS水平高于＜35歲組和35～39歲組(均P＜0.05)，精子DNA損傷率高于＜35歲組(P ＜0.05)，見表1。

表1 不同年齡組男性精液參數(shù)、精漿活性氧水平和精子DNA損傷的比較(±s)

表1 不同年齡組男性精液參數(shù)、精漿活性氧水平和精子DNA損傷的比較(±s)

＊與＜35歲組比較P＜0.05 #與35～39歲組比較P＜0.05

組別 n 精液量(ml)密度(×106/ml)a+b級(%)精子正常形態(tài)(%)MDA濃度(nmol/L)DNA損傷(%)＜35 歲組 40 2.89 ±1.05 72.33 ±38.15 51.50 ±14.33 15.18±7.23 9.26 ±5.41 15.40 ±5.92 35 ～39 歲組 34 2.99 ±1.15 75.47 ±40.69 50.88 ±12.28 15.26 ±8.88 11.37 ±8.54 17.19 ±9.18≥40 歲組 21 2.47 ±1.02 72.29 ±32.83 43.57 ±12.56* 11.55 ±8.48 17.66 ±7.73*# 21.12 ±11.01*

2.2 精漿ROS水平和精子DNA損傷與男性年齡的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)分析，精漿ROS水平和精子DNA損傷與男性年齡呈明顯正相關(guān)性(r=0.43，P ＜0.05;r=0.27，P ＜0.05)，隨男性年齡增加 ROS水平和精子DNA損傷增加。

3 討論

長期以來，人們普遍關(guān)注女性年齡對生育的影響，35歲后生育能力開始下降，最終導(dǎo)致妊娠率下降和流產(chǎn)率升高［3］。男性生育力可維持到較高年齡，但隨著年齡的增加，男性的生殖功能逐漸減退，表現(xiàn)為生殖激素水平的改變和精液質(zhì)量的下降，遺傳風(fēng)險(xiǎn)性增高。隨著生育年齡的推遲，研究精子功能與年齡變化顯得尤為必要與迫切，氧離子、自由基和過氧化物等活性物質(zhì)統(tǒng)稱為ROS。ROS在生理狀態(tài)可調(diào)節(jié)精子的功能，少量持續(xù)的ROS是精子受精、獲能等生理過程所必需的，但過量ROS造成氧化應(yīng)激，會導(dǎo)致精子膜損傷，影響精子功能。精子膜含有大量多聚脂肪酸，這一特殊結(jié)構(gòu)使精子膜對ROS的水平變化尤其敏感，極易受到ROS的攻擊而發(fā)生氧化應(yīng)激損傷［4，5］。在眾多與男性不育有關(guān)的因素中，ROS已成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。但男性年齡與ROS的相關(guān)性研究甚少。精子作為遺傳物質(zhì)的主要傳遞者，對后代的種族繁衍具有重要意義，精子DNA損傷情況將直接影響精子的質(zhì)量及下一代的生長發(fā)育，DNA雙鏈容易變性成為單鏈DNA，這些損傷與胚胎著床前發(fā)育不良、早期流產(chǎn)率的升高均有關(guān)［6］。同時(shí)增加遺傳性疾病、出生缺陷的易感性，甚至引起子代異常［7］。精子DNA完整性在男性生育中具有重要作用。研究年齡和DNA損傷關(guān)系尤為重要。

隨著年齡增加，精液一些基本參數(shù)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為射精量減少、精子活力低下，精子形態(tài)正常率隨年齡增長有顯著降低的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)≥40歲組前向運(yùn)動精子百分率較＜35歲組降低，在其它參數(shù)如精液量、濃度、正常形態(tài)方面未發(fā)現(xiàn)差異，可能與樣本例數(shù)少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨男性年齡增加精漿ROS水平增加。與Wyrobek等［8］報(bào)道無論不育男性還是正常男性，隨年齡增長精子DNA氧化應(yīng)激損傷增加的結(jié)果相符合。高ROS可以使精子膜結(jié)構(gòu)的完整性破壞，膜通透性增加，失去了對參與精子運(yùn)動調(diào)控的有關(guān)胞內(nèi)離子濃度的調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致精子運(yùn)動能力下降甚至喪失［9］。本文中≥40歲組精子活動力下降，是否與ROS水平增高有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。此外，高水平的ROS可導(dǎo)致DNA單鏈的形成和雙鏈的斷裂，從而影響精子DNA完整性，誘導(dǎo)精子DNA損傷［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷的比率與男性年齡呈明顯正相關(guān)性(r=0.27，P＜0.05)，隨男性年齡增加，精子DNA損傷增加。與Schmid等［11］對80位不吸煙的健康人進(jìn)行精子DNA損傷檢測，結(jié)果顯示男性年齡增長與精子DNA損傷有關(guān)聯(lián)的結(jié)果相符合。此外Vagnini等［12］使用TUNEL法對508例男性精液檢測，其發(fā)現(xiàn)與男性年齡增長和精子DNA損傷有關(guān)聯(lián)的結(jié)果相符合。隨著男性年齡的增加，可能會導(dǎo)致精子DNA損傷的增加，因本研究樣本例數(shù)偏少，精子DNA損傷與年齡的關(guān)系還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。鑒于精子DNA損傷對男性生育的重要性，男性年齡也應(yīng)引起關(guān)注。

精液中的ROS和精漿抗氧化能力保持平衡，當(dāng)精液中的ROS增加或精漿抗氧化能力減低時(shí)，這種平衡被打破，導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生［13］。隨著年齡增長，細(xì)胞、組織和器官的氧化損傷和抗氧化能力降低，也可能是活性氧增加的一個(gè)原因。隨著男性年齡增長，睪丸、輸精管、前列腺和附睪等生殖器官的器質(zhì)性改變，可能會影響整個(gè)生精過程和精液質(zhì)量，導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，引起精子DNA損傷增加。父代精子DNA的損傷又與子代兒童癌癥的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)。新的研究也證明精子DNA損傷與男性年齡以及某些遺傳性疾病存在一定關(guān)系［14］。Singh等［15］發(fā)現(xiàn)年齡增大，精子DNA更易受損且損傷更為嚴(yán)重。高齡對生育能力及后代生長發(fā)育的影響是個(gè)不容忽視的問題。

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