殷玉紅 田小燕 宋海燕 紀英 楊穎博 王桂東 李艷穩(wěn)

在糖尿病腎病中，蛋白尿是其目前公認的早期臨床表現(xiàn)，并且是促進糖尿病腎病進展的重要因素之一。緊密連接蛋白的異常表達與濾過膜的通透性改變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。ZO-1表達于多種上皮細胞，是維持黏膜通透性的重要組成部分。實驗證明ZO-1參與了缺血缺氧誘導(dǎo)的血腦屏障通透性增加［1］，并且在腸黏膜通透性增加中也發(fā)揮重要作用［2］。在糖尿病腎病模型中發(fā)現(xiàn)，ZO-1在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程中其表達逐步減少，與尿蛋白呈負相關(guān)［3］。腎炎四味片具有減少尿蛋白、保護腎功能的作用，在糖尿病腎病中的治療作用已得到廣泛認可，但其作用機制目前尚未完全明了。本實驗應(yīng)用腎炎四味片干預(yù)糖尿病大鼠，探討其是否通過調(diào)節(jié)ZO-1的表達來減輕糖尿病大鼠尿蛋白的排泄及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體重180～220 g，8周齡，由河北醫(yī)科大學動物中心提供。隨機分成3組:正常組，糖尿病組和腎炎四味片組，每組12只。所有動物均自由攝取飲食及飲水，喂標準大鼠食物。

1.1.1 糖尿病動物模型建立:腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(2%STZ)溶液，72 h后，采取尾靜脈血測定血糖值。以血糖≥16.7 mmol/L作為大鼠糖尿病成模標準。大鼠自由進標準飲食，實驗期間不給予任何降糖藥物。

1.1.2 藥物干預(yù):腎炎四味片對患者的劑量為3 g，3次/d。依據(jù)定量藥理學中有關(guān)不同種屬動物間的劑量換算方法推算大鼠的用藥劑量為10mg·kg－1·d－1，每天給予糖尿病組大鼠灌胃1次。其余2組均灌胃等量自來水。于成模8、12周處死各組大鼠6只。

1.2 標本采集

1.2.1 尿液標本:實驗8、12周末，3組隨機各取6只大鼠，收集并記錄大鼠24 h總尿量，留取5ml，測尿白蛋白排泄率。

1.2.2 血液標本:糖尿病大鼠模型建立72 h后，取大鼠尾尖血，做血糖測定。在實驗8、12周末，從每組隨機取出的6只大鼠，乙醚吸入麻醉，稱體重，斷頭取血，做血肌酐測定。

1.2.3 腎組織的處理:取腎組織，體積小于2cm×2cm×0.4cm，用多聚甲醛液固定，做免疫組織化學檢查;剩余的腎臟組織置于－80℃液氮速凍后保存，做PCR。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 血尿生化指標測定:血肌酐、尿肌酐測定均用Ci-8200全自動生化儀，尿白蛋白排泄率測定采用放免法。

1.3.2 免疫組化:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫溫室孵育10～15min，微波修復(fù)抗原10min，用正常小牛血清封閉非特異性抗原，滴加一抗(兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體)，4°C孵育過夜。加入生物素標記的二抗工作液，室溫下孵育30min。滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度脫水、二甲苯透明、中型樹膠封片。陰性對照組用PBS代替一抗。陽性反應(yīng)部位為棕褐色。應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)做半定量分析，每張切片隨機選取10個腎小球(200倍)，測量積分光密度。

1.3.3 透射電鏡檢查(TEM):取腎皮質(zhì)組織，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，用2.5%戊二醛固定后，1%餓酸后固定，超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，H-7500透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.4 RT-PCR 應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，用分光光度儀檢測其含量，RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.8～2.0。分裝，置于 －80°C 冰箱保存。0.2 μg總 RNA 以 Random 9mers為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。以cDNA為模板，Taq DNA多聚酶催化下，進行 PCR擴增。引物序列為:上游引物:5’-TGCTCCAGCAGGTCCTAAGT-3，下 游 引 物:5’-TGGTAGCTGAGGGCAGAACT-3，產(chǎn)物191bp。β-actin引物序列:上游引物:5’-AGCCATGTACGTTAGCCATCC-3，下 游 引 物:5’-CTCT-CAGCTGTGGTGGTGAA-3，產(chǎn)物228bp。ZO-1基因擴增條件為:94℃ 5min，然后 94℃30 s，59℃45 s，72℃30 s(30 個循環(huán))，72℃延伸5min。擴增目的片段長度為191 bp。β-actin基因擴增條件為:94℃ 5min，然后 94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s(31個循環(huán))，72℃延伸5min。擴增目的片段長度為228 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，紫外燈下拍照，用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以與β-actin吸光度的比值表示其相對含量。

1.5 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SAS 9.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用Pearson方法進行相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎重/體重、血糖、24 h尿蛋白定量、肌酐清除率的變化實驗8、12周時，血糖、腎重/體重、肌酐清除率和24 h尿蛋白，糖尿病組和腎炎四味片組明顯高于正常組(P＜0.01);腎炎四味片組較糖尿病組低(P＜0.05)。見表1。

表1 生化指標的變化 n=6，

表1 生化指標的變化 n=6，

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與糖尿病組比較，#P ＜0.05

組別 血糖(mmol/L)24 h尿蛋白(mg) 肌酐清除率(ml/min) 腎重/體重(mg/g)正常組8 周 6.11 ±0.22 13.8 ±1.8 2.84 ±1.12 4.0 ±0.412 周 6.21 ±0.25 23.4 ±7.4 2.92 ±0.99 4.2 ±0.4糖尿病組8 周 28.37 ±5.65* 276.0 ±71.3* 5.87 ±0.26* 7.0 ±0.3*12 周 26.68 ±6.18* 320.0 ±64.8* 5.95 ±0.21* 7.1 ±0.4*腎炎四味片組8 周 26.68 ±6.57* 140.7 ±11.1*# 4.68 ±0.37*# 5.7 ±0.4*#12 周 26.79 ±6.03* 226.7 ±50.9*# 4.89 ±0.34*# 5.8 ±0.4*#

2.2 病理組織學改變 光鏡檢查:PAS染色顯示糖尿病組腎小球直徑均增大，PAS紅染區(qū)均明顯增寬，12周時變化較8周時加重，正常組無上述變化。腎炎四味片組較糖尿病組變化減輕。電鏡檢查:8周時糖尿病組腎小球基底膜明顯不規(guī)則增厚，部分裂孔隔膜消失、足突融合，系膜區(qū)增寬，細胞外基質(zhì)增多，毛細血管部分內(nèi)皮細胞窗孔結(jié)構(gòu)消失，12周時變化則更為明顯。腎炎四味片組變化較糖尿病組明顯減輕，正常組無上述變化。

2.3 腎皮質(zhì)ZO-1蛋白表達 免疫組化染色顯示正常組大鼠腎組織ZO-1沿腎小球毛細血管袢呈均勻的點線狀分布。8、12周時，糖尿病組ZO-1染色強度較正常組明顯降低(P＜0.01)。8周時腎炎四味片組ZO-1表達較糖尿病組明顯增加(P＜0.05)，與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。而12周時腎炎四味片組ZO-1表達較糖尿病組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 ZO-1蛋白表達變化 n=6，

表2 ZO-1蛋白表達變化 n=6，

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與糖尿病組比較，#P ＜0.05

組別ZO-1正常組8周20.9 ±7.412 周 21.5 ±7.5糖尿病組8周7.4 ±1.8*12 周 7.2 ±3.8*腎炎四味片組8周12.8 ±6.4*#12 周 9.8 ±1.4*#

2.4 腎皮質(zhì)ZO-1 mRNA的表達 8周時，與正常組比較，糖尿病組ZO-1 mRNA表達明顯降低(P＜0.01)，腎炎四味片組ZO-1 mRNA表達較糖尿病組增加(P＜0.05)。12周時糖尿病組ZO-1 mRNA表達進一步降低(P＜0.01)，腎炎四味片組其表達雖增加，差異卻無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 ZO-1 mRNA/β-actin mRNA表達變化 n=6，

表3 ZO-1 mRNA/β-actin mRNA表達變化 n=6，

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與糖尿病組比較，#P ＜0.05

組別 ZO-1 mRNA/β-actin mRNA 0.31 ±0.02正常組8 周 0.59 ±0.0312 周 0.59 ±0.02糖尿病組8 周 0.48 ±0.02*12 周 0.28 ±0.01*腎炎四味片組8 周 0.55 ±0.07*#12周

3 討論

足細胞之間通過裂孔隔膜相連，是腎小球濾過膜的最外層細胞，足細胞之間連接的完整性對腎小球濾過膜通透性起著重要作用。ZO-1是第1個發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)蛋白，屬于跨膜蛋白，可以起到連接跨膜蛋白、occluden和肌動蛋白細胞骨架的作用，對于細胞間緊密連接的形成具有非常重要的作用。實驗證實ZO-1在腦皮質(zhì)、肺組織及耳蝸、腸黏膜上皮細胞均有表達，且參與缺血、缺氧誘導(dǎo)的血腦屏障通透性增加［1］，酒精誘導(dǎo)的腸黏膜上皮細胞通透性增加［2］。ZO-1在腎小球則主要集中于足細胞足突胞質(zhì)側(cè)，在裂孔隔膜附近表達。

ZO-1屬于鳥苷酸激酶家族，含PDZ區(qū)、SH3區(qū)及鳥苷酸區(qū)，與足細胞骨架蛋白-f-肌動蛋白、α-actinin-4以及裂孔隔膜分子(neph-1)相連。其在緊密連接的組裝及發(fā)揮正確功能中具有重要作用。ZO-1的第1個功能區(qū)可和neph-1羧基端的最后3個氨基酸結(jié)合和相互作用，顯著增加neph-1胞內(nèi)功能區(qū)酪氨酸的磷酸化，改變neph-1的磷酸化狀態(tài)及誘導(dǎo)其信號傳導(dǎo);ZO-1和actin細胞骨架相互作用并將其相關(guān)蛋白連接到actin細胞骨架上，這對維持足突結(jié)構(gòu)的完整性尤其重要［4］。Rincon在1型及2型糖尿病動物模型及暴露于高糖的腎小球上皮細胞中均發(fā)現(xiàn)ZO-1表達的減少，應(yīng)用免疫金電鏡觀察到ZO-1的表達有從胞膜到胞質(zhì)的改變，同時足細胞對血漿白蛋白的通透性增加［5］，這與我們觀察到的結(jié)果一致［3］。

糖尿病腎病的發(fā)生與其腎組織內(nèi)炎性細胞浸潤有關(guān)。Sassy等［6］在1型糖尿病模型中發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病發(fā)生過程中存在炎性介質(zhì)與巨噬細胞的動態(tài)變化，在第1天，腎小球內(nèi)白細胞介素-1(IL-1)，細胞間黏附因子(ICAM-1)表達增加，第2天其相應(yīng)的mRNA表達開始增加;Chow等［7］在db/db小鼠糖尿病模型(Ⅱ型糖尿病)中發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病時間的延長，腎小球及腎小管-間質(zhì)巨噬細胞浸潤逐漸增多，并與血糖、血紅蛋白A1c(HbA1c)、尿白蛋白、血肌酐等水平呈正相關(guān)。

腎炎四味片由細梗胡枝子、石韋、黃芪、黃芩等藥物組成。主要功效為活血化瘀，清熱解毒，補腎益氣，臨床上用于治療慢性腎炎，療效確切。具有減少尿蛋白，保護腎功能的作用。黃酮類化合物為細梗胡枝子的主要有效成分，可通過抑制白介素-8(IL-8)，TNF-α的分泌，從而調(diào)整免疫系統(tǒng)，減輕炎性細胞在腎內(nèi)的積聚。余凌等［8］應(yīng)用腎病綜合征鼠模型證實黃芪當歸合劑具有與ACEI類藥物相似的腎臟保護作用，主要通過減輕腎小管間質(zhì)損傷來發(fā)揮作用。黃芪多糖可明顯降低腎皮質(zhì)Na+-K+ATP酶活性，從而防止腎功能失代償來發(fā)揮腎臟保護作用。另有報道:黃芪總皂甙、白術(shù)糖復(fù)合物、黃酮組成的復(fù)方能促進ZO-1蛋白的表達［9］。而在本實驗中發(fā)現(xiàn)腎炎四味片可改善ZO-1表達的降低，延緩腎臟病進展，起到腎臟保護作用。

緊密連接蛋白ZO-1在腎臟存在于腎小球足細胞的緊密連接中，其存在及正確定位對于腎小球濾過膜的通透性的保持具有重要作用。腎炎四味片具有腎臟保護作用，一方面通過減輕腎臟炎性介質(zhì)的積聚發(fā)揮作用，另一方面還可改善ZO-1的表達從而發(fā)揮腎保護作用。

1 吳麗文，尹飛，彭鏡，等.緊密連接蛋白ZO-1、occludin和actin參與缺血缺氧誘導(dǎo)的血腦屏障通透性增加.中國當代兒科雜志，2008，4:513-516.

2 高志光，秦環(huán)龍.腸上皮細胞緊密連接的生物學功能及在腸屏障中的作用.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2005，12:299.

3 殷玉紅，李英.ZO-1在糖尿病大鼠腎組織中的表達及貝那普利對其的干預(yù)作用.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2009，8:678-682.

4 Gonzalez-Mariscal L，Betanzos A，Avila-Flores A.Maguk proteins:structure and role in the tight junction.Semin Cell Dev Biol，2006，11:315-324.

5 Hernan Rincon-Choles，Tetyana L，Vasylyeva，et al.ZO-1 Expression and Phosphorylation in Diabetic.Nephropathy Diabetes，2006，55:894-900.

6 Sassy PC，Heudes D，Mandet C，et al.Early glomerular macrophage recruitment in streptozotocin-induced diabetic rats.Diabetes，2000，49:466-475.

7 Chow F，Ozols E，David J，et al.Macrophage in mouse type 2 diabetic nephropathy:Correlation with diabetic state and progressive renal injury.Kidney Int，2004，65:116-128.

8 余凌，張俊峰，李京子，等.黃芪當歸合劑防治腎病綜合癥鼠進行性腎小管間質(zhì)損傷.中華腎臟病雜志，2000，5:282-286.

9 李秋霞，羅茂林，李茹柳，等.緊密連接蛋白ZO-1研究概述.廣州中醫(yī)藥大學學報，2007，11:523-526.