袁 軍，許香雅，沈榕強(qiáng)

(福建農(nóng)林大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

乳酸脫氫酶(lactate dehydmgenaLse，LDH)是糖代謝中的主要酶類，可催化生物體內(nèi)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中Warburg效應(yīng)的重要效應(yīng)酶。Warburg效應(yīng)是指腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中，能量獲得方式由有氧方式轉(zhuǎn)化為無氧糖酵解方式的現(xiàn)象。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，LDH存在3種亞基［1］，分別為A(或稱M亞基)、B(或稱H亞基)、C。研究表明，減少ldha基因的表達(dá)能減少細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和顯著地延長腫瘤的形成時(shí)間，因此，ldha基因在腫瘤的形成初期和腫瘤的發(fā)生過程中扮演著重要角色［2－3］。ldha基因編碼的LHD-A蛋白是腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子HIF-1α及c-Myc的效應(yīng)蛋白，它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，由于基因改變和腫瘤低氧癥，許多癌細(xì)胞消耗大量的葡萄糖并且通過LDH-A生成乳酸。LDH-A表達(dá)水平的變化直接關(guān)聯(lián)著腫瘤的發(fā)展程度［4］。此外，在人體內(nèi)LDH-A同工酶譜的變化也可從一定程度上反映組織器官的病變，對(duì)診斷心腦血管疾病、呼吸道疾病、肝臟疾病、腫瘤等均有重要參考價(jià)值。為了得到LDH-A的純蛋白，以便在腫瘤相關(guān)通路中進(jìn)行LDH-A蛋白水平的檢測(cè)，并進(jìn)一步闡明ldha基因作用的分子機(jī)理，本文對(duì)Hela細(xì)胞中的LDH-A蛋白編碼基因進(jìn)行了克隆，并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所涉及的菌株見表1，質(zhì)粒見表2。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的菌株

表2 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I和 HindⅢ、Taq酶、T4－DNA連接酶、卡那霉素(Kan)均購自Takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技公司。RNA提取試劑TRIzol Reagent購自lnvitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自Tiangen公司。IPTG(異丙基硫代－β－D半乳糖苷)購自Sigma公司。丙烯酰胺和N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺為Bio-Rad公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.2 表達(dá)載體pET28a(+)－ldha的構(gòu)建

參照TRIzol(Invitrogen)說明書的方法提取Hela細(xì)胞中的總RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA過程按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。從Genebank獲得ldha基因的全核苷酸序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ldha基因編碼序列所需的引物，F(xiàn):5’－下劃線部分分別為 EcoR I和HindⅢ的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下:10×EX Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L－1)1 μL，引物(20 μmol·L－1)各 0.3 μL，模板 1 μL，EX Taq 酶(2.5 U·μL－1)0.2 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)32次后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a(+)經(jīng)純化后，用EcoR I和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，然后用T4-DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。涂布于LB+Kan平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于4 mL LB+Kan培養(yǎng)基中，于 37℃ 180 r·min－1搖床培養(yǎng)16h。挑取陽性克隆做PCR及酶切驗(yàn)證。將經(jīng)驗(yàn)證的陽性克隆子送公司測(cè)序后與ldha基因原序列進(jìn)行同源性比對(duì)。序列正確的質(zhì)粒即為獲得的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)－ldha。實(shí)驗(yàn)具體操作方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［5］。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)－ldha和 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)單菌落，分別接種于4 mL含卡那霉素(10 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜。按1%接種量分別將菌體轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ～0.8，加 IPTG 至終濃度 1.0 mmol/L，28℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。然后4℃離心1 min(12 000 r·min－1)，棄上清留菌體沉淀，再用 80 μL 5×SDS-PAGE樣品緩沖液重懸，放入100℃沸水煮3 ～5 min 后取出，離心5 min(12 000 r·min－1)，上清液用于SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ldha基因的克隆

參照TRIzol說明書的方法獲得了Hela細(xì)胞的總RNA，提取結(jié)果如圖1所示。以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，與合成的引物擴(kuò)增得到ldha目的基因片段，大小為999 bp(圖2)，與預(yù)期大小相符。

圖1 Hela細(xì)胞中抽提的總RNA

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物與載體pET28a(+)具有相同酶切位點(diǎn)，通過酶切與連接，將目的基因ldha構(gòu)建到了載體pET28a(+)上，形成了表達(dá)載體 pET28a(+)－ldha(圖3)。

圖2 ldha基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 pET28a(+)－ldha原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將構(gòu)建好的載體pET28a(+)－ldha轉(zhuǎn)化為E.coli BL21(DE3)，經(jīng)培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒做PCR和雙酶切驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)得到大小為999 bp的核苷酸片段(圖4)與理論推測(cè)一致。用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后檢測(cè)得到2條大小分別為5 350 bp和989 bp的核苷酸片段(圖5)，表明ldha基因片段已連接到質(zhì)粒pET28a(+)上。將陽性克隆子送至生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與ldha原序列用軟件DNAMAN比對(duì)兩者的同源性，結(jié)果顯示同源性為100%，說明ldha基因已成功插入pET28a(+)載體中，進(jìn)一步證明了表達(dá)載體pET28a(+)－ldha構(gòu)建成功，可供后續(xù)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)使用。

圖4 重組質(zhì)粒pET28a(+)－ldha的PCR驗(yàn)證

圖5 質(zhì)粒pET28a(+)－ldha酶切驗(yàn)證

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑取經(jīng)驗(yàn)證正確的陽性克隆子E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)－ldha與空載體對(duì)照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)菌株 OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)將其用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分子量為36 kDa處有一明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶(圖6)，蛋白大小與理論推測(cè)值一致，而對(duì)照空載菌株則幾乎沒有該蛋白表達(dá)條帶，說明該蛋白條帶為LDH-A蛋白表達(dá)條帶。

圖6 E.coli BL21(DE3)/pET28A(+)－ldha表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

3 討論

乳酸脫氫酶是以NAD為輔酶，催化生物體內(nèi)糖代謝過程中乳酸與丙酮酸之間可逆反應(yīng)的一組同工酶。作為糖酵解途徑中一種重要的酶，它廣泛存在于生物體內(nèi)，并具有組織器官特異性。乳酸脫氫酶在人體中主要分布于腎、心肌、肝、脾、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等組織或器官中［6］。而腫瘤細(xì)胞具有一種獨(dú)特的代謝途徑，它的糖酵解進(jìn)行的順序與三羧酸循環(huán)缺少聯(lián)系，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞利用葡萄糖的量會(huì)比正常組織細(xì)胞高5～10倍，其中多數(shù)轉(zhuǎn)變成了乳酸鹽。許多腫瘤相關(guān)研究表明，患者的發(fā)作期，無論初發(fā)或復(fù)發(fā)，其血清LDH水平均較正常明顯增高，患者癌細(xì)胞中的LDH顯著高于正常組織［7－8］，可作為代表全身腫瘤細(xì)胞負(fù)荷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與上述腫瘤細(xì)胞的代謝特性有關(guān)。但是，目前對(duì)于癌基因和糖酵解的關(guān)聯(lián)還了解甚少，已證明了ldha是c-Myc致癌轉(zhuǎn)錄因子的直接靶基因［9－10］。此外，腫瘤細(xì)胞中低氧癥可誘導(dǎo)因子(HIF－1)能調(diào)控LDH-A［11－12］，如敲除或減少 LDH-A 可明顯抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受力。接種了敲除或降低LDH-A表達(dá)的患癌小鼠，生存時(shí)間明顯延長［13］。減少ldha能抑制腫瘤初期的形成及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這是因?yàn)樵谡＝M織細(xì)胞中既不會(huì)含氧低也沒有活化的c-Myc，而在腫瘤細(xì)胞中含氧量低［10］。ldha基因表達(dá)的減少會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和腫瘤細(xì)胞死亡。

在本實(shí)驗(yàn)中，將ldha基因構(gòu)建到表達(dá)載體pET28a(+)中，得到重組表達(dá)載體pET28a(+)－ldha，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，獲得了重組菌株。在IPTG誘導(dǎo)下，ldha基因在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)，這為今后LDH-A蛋白的快速檢測(cè)，闡明ldha基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展及其他重大疾病中的關(guān)鍵作用提供了參考。

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