孫 鵬，程建軍

大豆分離蛋白-麥芽糊精聚合物的結(jié)構(gòu)特征

孫 鵬，程建軍*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

以大豆分離蛋白(SPI)和麥芽糊精(MD)為原料制備不同接枝度的SPI-MD聚合物，通過(guò)巰基含量測(cè)定、SDSPAGE凝膠電泳、差式量熱掃描、傅里葉紅外光譜、電子掃描顯微鏡和圓二色譜分析SPI和不同接枝度(10%、20%、30%、40%)SPI-MD聚合物結(jié)構(gòu)特征的變化。結(jié)果表明:隨著接枝度的提高，SPI-MD聚合物的巰基含量逐漸降低、變性溫度先提高后降低、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)含量減少以及β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增多；并且證明了SPI和MD是以共價(jià)鍵的結(jié)合方式聚合及SPI中7S與MD反應(yīng)活性較高；SPI-MD聚合物的微觀結(jié)構(gòu)松散，呈多孔狀。

大豆分離蛋白；麥芽糊精；聚合物；結(jié)構(gòu)特征

大豆具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成理想以及大豆蛋白的功能性有助于食品體系形成等特點(diǎn)而成為人類重要的食物資源[1-3]；但是隨著人們生活水平的不斷提高，大豆蛋白在食品工業(yè)中應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，其在實(shí)際應(yīng)用上也表現(xiàn)出了許多缺陷。所以，對(duì)大豆蛋白的改性也逐漸成為現(xiàn)在人們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。大豆蛋白-糖接枝聚合改性，為化學(xué)改性范疇，是目前大豆蛋白改性中較為理想的方法，它主要是基于蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基和糖分子還原末端的羧基之間的羰氨反應(yīng)，又屬于美拉德反應(yīng)[4]。

蛋白質(zhì)的肽鏈由氨基酸單體隨機(jī)組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜；蛋白質(zhì)的肽鏈?zhǔn)情L(zhǎng)鏈分子，在處于伸展?fàn)顟B(tài)時(shí)，具有較高的能態(tài)，只有降低分子的內(nèi)能，才會(huì)使分子處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；因而，蛋白質(zhì)的肽鏈會(huì)自發(fā)地通過(guò)許多和α-碳原子或肽平面鍵間的單鍵旋轉(zhuǎn)，同時(shí)伴隨著分子內(nèi)大量的原子和基團(tuán)間的相互作用來(lái)降低內(nèi)能，折疊成為一個(gè)空間內(nèi)較為穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次可劃分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)[5-7]。當(dāng)大豆蛋白分子上引入麥芽糊精后，大豆蛋白分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其功能性也會(huì)改變[8-9]。大豆分離蛋白-麥芽糊精(SPI-MD)聚合物是較為復(fù)雜的高分子化合物，目前關(guān)于其結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)主要探討SPI-MD接枝聚合反應(yīng)后，不同接枝度的SPI-MD聚合物在結(jié)構(gòu)特征方面的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(粗蛋白含量90.3%，水分含量5.3%) 黑龍江哈爾濱高新科技；麥芽糊精(DE=15～20，水分≤6%)長(zhǎng)春帝豪食品科學(xué)發(fā)展有限公司。

5,5,-二巰基二硝基苯甲酸(DTNB) 美國(guó)Amresco公司；硫酸鉀、硫酸銅、氫氧化鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；溴化鉀、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素 美國(guó)Sigma公司；除溴化鉀為色譜純外，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-80水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司；FD-5型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Dold Sim公司；PE Pyris-6差示掃描量熱儀 美國(guó)PE公司；BGPower-600i迷你型電泳儀 北京百晶公司；S-3400N電子掃描顯微鏡 日本Hitachi公司； J-810圓二色譜儀 日本Jasco公司；VERTEX-70傅里葉紅外色譜儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Xin Gu[10]、Guan Junjun[11]等的方法。稱取一定量的SPI，溶于超純水中，在30℃條件下磁力攪拌2h，2000×g離心30min后所得上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，GB 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定SPI的質(zhì)量濃度。

1.3.2 SPI-MD接枝聚合物的制備

按文獻(xiàn)[8]的方法，制備接枝度為10%、20%、30%、40%的 SPI-MD接枝聚合物，具體反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 不同接枝度的反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions for different grafting degrees

1.3.3 巰基(—SH)含量的測(cè)定

參考Xin Gu[10]、Tang Chuanhe[12]等的方法。自由巰基的測(cè)定，以超純水溶解樣品，質(zhì)量濃度5mg/mL。600μL樣品溶液與4mL的緩沖液T(0.086mol/L Tris-0.09mol/L甘氨酸-4mmol/L Na2EDTA，pH8.0)和400μL 20mmol/L DTNB混合。樣品與4mL緩沖液T混合不加DTNB做空白?？値€基的測(cè)定，建議改為:緩沖液T以緩沖液U (T-6mol/L尿素-0.5% SDS)替代，其他同上。樣品與4mL緩沖液U混合不加DTNB做空白。溶液經(jīng)漩渦后在室溫條件下靜置15min，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)412nm處測(cè)其吸光度(A412nm)，巰基含量計(jì)算如下式所示。

式中:ρ為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(g/100mL)。

1.3.4 差示掃描量熱(DSC)分析

依據(jù)Tang Chuanhe等[13]的方法。利用PE Pyris 6-DSC熱力分析儀測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的熱力學(xué)特性。稱取2mg的樣品放入鋁盒中，再向其中加入0.01mol/L的磷酸緩沖溶液10μL (pH7.0)，壓蓋密封，室溫(25℃)條件下平衡6h；將平衡好的樣品鋁盒放入到DPS操作臺(tái)左側(cè)，空白鋁盒放置在右側(cè)；測(cè)試溫度以10℃/min從30℃到180℃，在180℃保持1min，隨后以30℃/min從180℃降溫至30℃。記錄此過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性峰值溫度(t)和熱焓變(ΔH)。

1.3.5 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

參考管軍軍[14]、王斌[15]等的方法。樣品采用鹵化物壓片法進(jìn)行測(cè)定，將2mg樣品與200mg的溴化鉀粉在紅外燈下的瑪瑙研缽中充分混合磨細(xì)，使平均粒徑約2μm，將樣品移至模具內(nèi)，放在壓片機(jī)上加壓，形成一透明小圓片，即可進(jìn)行測(cè)試。紅外光譜儀操作條件為:分辨率4cm-1，全波段掃描范圍4000～500cm-1。

1.3.6 SDS-PAGE凝膠電泳分析

參考Laemmli[16]的方法。具體方法如下，選取12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳。電泳前樣品沸水浴處理5min，吸取樣品10μL上樣，選取Marker范圍為14.4～97.4kD。起始電壓70V，待樣品進(jìn)入分離膠，調(diào)整電壓為120V。染色劑為2.5g/L考馬斯亮藍(lán)R-250的V甲醇:V水:V冰乙酸＝23:23:4的混合溶液，脫色劑為V甲醇:V水: V冰乙酸＝9:9:2混合溶液。

1.3.7 電子掃描顯微鏡(SEM)分析

樣品進(jìn)行粘臺(tái)處理，放入離子濺射鍍射儀中經(jīng)15min的減壓過(guò)程后，對(duì)樣品離子濺射鍍膜約10min，然后將樣品移至掃描電鏡中觀察并拍照。

1.3.8 圓二色譜(CD)分析

參考Gorinstein等[17]的方法。稱取一定量已純化的樣品及SPI，用重蒸水溶解，使蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.2mg/mL，在圓二色譜儀上測(cè)定。測(cè)定條件:光徑0.1cm，溫度26℃，靈敏度20mdeg，掃描速率100nm/min，掃描范圍190～250nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)于SPI與MD在某一條件上進(jìn)行研究時(shí)，反應(yīng)的其他條件均相同。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，而且重復(fù)3次；樣品的測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin8.0繪圖軟件、SPSS V13.0分析軟件、Microsoft Excel分析、OMNIC紅外分析軟件、CD Pro分析軟件等進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI-MD聚合物的—SH含量分析

圖1 SPI-MD聚合物的巰基含量Fig. 1 Sulphydryl group content of SPI and SPI-MD polymers

由圖1可知，當(dāng)總巰基恒定時(shí)，熱變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，使得游離巰基的含量有一定數(shù)量的增加。另一方面，糖和蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)熱處理后，如果有二硫鍵的形成，游離巰基和總巰基的含量都將會(huì)降低[10,18-19]。結(jié)果表明，隨著接枝度的增加，總巰基含量維持不變，游離巰基含量逐漸下降；總巰基含量的不變說(shuō)明在大豆分離蛋白和麥芽糊精反應(yīng)期間并沒(méi)有二硫鍵的生成，因此游離巰基與總巰基的含量百分比呈現(xiàn)出了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的伸展程度[10,20]。隨著接枝度的提高，巰基含量比卻逐漸下降(78.23%～62.24%)，這可能是麥芽糊精的存在阻礙了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展。

2.2 SPI-MD聚合物熱力學(xué)性質(zhì)(DSC)的分析

圖2 SPI-MD聚合物熱力學(xué)變化圖譜Fig. 2 Thermodynamic pattern of SPI-MD polymers

表2 SPI-MD聚合物熱力學(xué)綜合分析Table 2 Comprehensive thermodynamics analysis of SPI-MD polymers

蛋白質(zhì)的熱力學(xué)分析就是通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)在連續(xù)升溫中破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)所需的變性溫度和能量的變化情況。SPI樣品及不同接枝度的聚合物變性溫度的測(cè)定結(jié)果如圖2和表2所示，SPI 樣品及接枝度為10%、20%、30%、40%的 SPI-MD的變性峰值溫度分別為 86.1、89.3、91.3、96.2、89.5℃，它們的變性溫度相差較大，這說(shuō)明它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)與組成上有一定差異。一般情況下，蛋白質(zhì)的變性溫度會(huì)因自身交聯(lián)或由于分子內(nèi)暴露在外面的活性基團(tuán)形成了少量聚集體而提高[21]。30%接枝度的SPI-MD的DSC圖譜峰型很寬，峰值很高，推測(cè)可能是蛋白質(zhì)中的氫鍵嚴(yán)重被破壞，所得蛋白質(zhì)中含有很少的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，α-螺旋也較低，和圓二色譜分析結(jié)果相符。Ma等[22]認(rèn)為蛋白質(zhì)變性的熱焓值與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性存在著一定的相關(guān)性；Nagano等[23]認(rèn)為寬峰反映了蛋白質(zhì)改性后內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異，蛋白分子的氫鍵被嚴(yán)重破壞，使蛋白分子的構(gòu)象變?yōu)榻庑臓顟B(tài)，直接導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)α-螺旋含量的減少。

2.3 SPI-MD聚合物傅里葉紅外光譜(FTIR)的分析

圖3 SPI-MD聚合物的紅外光譜Fig.3 FTIR pattern of SPI-MD polymers

蛋白質(zhì)與糖共價(jià)結(jié)合以后，一個(gè)典型的特征之一是蛋白質(zhì)分子中羥基數(shù)目增加。在FTIR圖譜上的具體體現(xiàn)是在1260～1000cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰及在3700～3200cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)一寬峰[24]。由圖3可知，不同接枝度聚合物在1260～1000cm-1處有很強(qiáng)的吸收峰，且30%接枝度在此處有最強(qiáng)的吸收；在3700~3200cm-1處吸收變化不明顯，但均略高于SPI；由此可推測(cè)，SPI以共價(jià)鍵的結(jié)合形式引入了MD分子；使SPI的FTIR圖譜上1700～1500cm-1處很強(qiáng)的吸收峰在不同接枝度聚合物上卻明顯減弱[25-26]；此外，1900～1600cm-1是雙鍵伸縮振動(dòng)頻率區(qū)，C＝C雙鍵一般會(huì)出現(xiàn)在1680～1610cm-1范圍內(nèi)，因此MD分子的介入及反應(yīng)條件的影響可能使SPI分子內(nèi)的C＝C雙鍵數(shù)量發(fā)生了變化[15,24]。

2.4 SPI-MD聚合物微觀結(jié)構(gòu)(SEM)的分析

圖4 SPI-MD聚合物SEM微觀結(jié)構(gòu)圖譜Fig.4 SEM pattern of SPI-MD polymers

由圖4可知，SPI的顆粒表面特征與SPI-MD聚合物明顯不同，前者表面光滑、結(jié)構(gòu)緊實(shí)，后者結(jié)構(gòu)松散，質(zhì)地疏松，部分呈多孔狀，尤其是接枝度為30%的SPI-MD聚合物，其表面結(jié)構(gòu)和其他樣品有較大區(qū)別；這可能是糖的共價(jià)引入，使聚合物分子向外擴(kuò)散，一定程度上抑制了分子的聚集所引起的[14,27]。

2.5 SPI-MD聚合物SDS-PAGE凝膠電泳的分析

由圖5可知，與SPI樣品的電泳譜帶相比，隨著接枝度的增加，聚合物樣品中7S亞基和11S亞基組分的譜帶顏色變淺，而且譜帶位置略有遷移；這表明SPI中7S亞基和11S亞基均與MD發(fā)生了接枝反應(yīng)，使其含量降低。但卻未在其他位置出現(xiàn)新的電泳譜帶，這是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)通常在酸性條件下與蛋白質(zhì)分子上的游離氨基、巰基等活性基團(tuán)通過(guò)靜電等非共價(jià)作用結(jié)合，呈現(xiàn)出顏色反應(yīng)；當(dāng)SPI-MD進(jìn)行接枝反應(yīng)時(shí)，SPI的游離氨基被麥芽糊精占用而減少，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合機(jī)率降低，從而使高接枝度聚合物的電泳凝膠圖譜經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)不顯色；這也側(cè)面證明了SPI與MD的反應(yīng)是以共價(jià)鍵結(jié)合[14,27-28]。

此外還發(fā)現(xiàn)，隨著接枝度的增加，與11S亞基各組分的電泳譜帶相比，7S亞基的電泳譜帶顏色變化更明顯，到接枝度為40%時(shí)幾乎消失(第6泳道)。這表明SPI中7S亞基和麥芽糊精的接枝聚合反應(yīng)活性比11S酸性亞基和11S堿性亞基要高[29-30]。

圖5 SPI-MD聚合物SDS-PAGE電泳圖譜Fig. 5 SDS-PAGE electrophoresis pattern of SPI-MD polymers

2.6 SPI-MD聚合物圓二色譜(CD)的分析

表3 SPI和SPI-MD的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents of SPI and SPI-MD polymers %

圓二色譜是一種特殊的在波長(zhǎng)250nm以下的遠(yuǎn)紫外吸收光譜，由蛋白質(zhì)的光活性基團(tuán)肽鍵的電子躍遷所引起，主要生色團(tuán)是肽鏈[31]；蛋白質(zhì)的圓二色性是當(dāng)平面圓偏振光通過(guò)這些光活性的生色基團(tuán)時(shí)，光活性中心對(duì)平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生吸收差值，由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光[32]。不同的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生圓二色譜譜帶上的摩爾橢圓度(θ)不同，因此，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)紫外圓二色譜，能反映出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息[33]。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角4種。由表3可知，與SPI樣品相比，SPI-MD聚合物的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)含量減少，分別為23.9%、22.2%、21.1%%、21.6和3.2%、3.7%、3.9%、4.5%；β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增多，分別為45.4%、49.7%、50.5%、51.3%和27.5%、24.4%、24.5%、22.6%；這可能是由于麥芽糊精分子的引入，SPI分子充分伸展，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，由有序變?yōu)橄鄬?duì)無(wú)序[14]；另一個(gè)可促使大豆分離蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變的因素是熱處理，王文高等[34]熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，觀察構(gòu)象變化過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在65℃時(shí)SPI中的β-伴球蛋白開(kāi)始變性，至75℃變性基本完全，生成的β-折疊結(jié)構(gòu)含量不再增加。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)不同接枝度的SPI-MD聚合物結(jié)構(gòu)特征的研究，結(jié)果如下:隨著接枝度的提高，SPI-MD聚合物巰基含量逐漸下降；SDS-PAGE凝膠電泳表明麥芽糊精和7S亞基的反應(yīng)活性較高；差示量熱掃描發(fā)現(xiàn)隨著接枝度的增加，SPI-MD聚合物的變性溫度先提高后降低；傅里葉紅外光譜證明了SPI和MD是以共價(jià)鍵的結(jié)合方式接枝聚合；電子掃描顯微鏡的觀察看出SPI-MD聚合物呈多孔狀，結(jié)構(gòu)松散；圓二色譜分析得出，與SPI樣品相比，SPI-MD聚合物的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)含量減少，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增多，分子結(jié)構(gòu)變的相對(duì)無(wú)序。

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Structural Characterization of Soybean Protein Isolate-Maltodextrin Polymers

SUN Peng，CHENG Jian-jun*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The sulphydryl group contents of soy protein isolate (SPI) and its polymer complexes with maltodextrin (MD) at different degrees of grafting (10%, 20%, 30% and 40%) were determined. At the same time, SPI and four polymer complexes were analyzed by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), differential scanning calorimeter, Fourier transform infrared spectroscopy, scanning electron microscope and circular dichroism. The results showed that SPI-MD polymers revealed a gradual decrease in sulphydryl group content, an initial increase and then a decrease in denaturation temperature, a reduction in α-helical and β-turn and an increase in β-sheet and random coil structure with increasing grafting level. SPI molecules could be grafted with MD molecules by covalent bonds between 7S in SPI molecules and MD. The structure of SPI-MD was porous and loose.

soyprotein isolate；maltodextrin；polymer；structural characterization

TS214.2

A

1002-6630(2012)15-0166-05

2012-04-11

孫鵬(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:geye815@126.com

*通信作者:程建軍(1969—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail:cheng577@163.com