閆樹軍，王 遠(yuǎn)，蘇艷紅，饒?jiān)谏?，?暉

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

響應(yīng)面法優(yōu)化油橄欖葉中橄欖苦苷超聲輔助提取工藝

閆樹軍，王 遠(yuǎn)，蘇艷紅，饒?jiān)谏?，?暉*

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

目的：研究油橄欖葉中橄欖苦苷超聲輔助提取最佳工藝條件。方法：選定甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間作為影響因素，以橄欖苦苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)，建立橄欖苦苷提取率的二次多項(xiàng)式回歸方程，經(jīng)響應(yīng)面回歸分析得到優(yōu)化組合條件。結(jié)果：最佳工藝條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)93.5%、料液比1∶25(g/mL)、提取時(shí)間26min。結(jié)論：油橄欖葉中橄欖苦苷提取率可達(dá)7.83%。

油橄欖葉；橄欖苦苷；超聲提??；響應(yīng)面分析

油橄欖(Olea europare Linn)又名洋橄欖、齊墩果、阿列布等，為木犀科、木犀欖屬常綠喬木，主要分布在地中海沿岸國家和美國加州地區(qū)，現(xiàn)在世界各國均有栽培[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)油橄欖葉中含有大量的生物活性物質(zhì)，主要成分有裂環(huán)環(huán)烯醚萜及其苷(橄欖苦苷為主要成分)、黃酮及其苷、雙黃酮及其苷、低分子單寧等。現(xiàn)代藥理研究表明，橄欖苦苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、抗氧化，以及抗癌和降血糖等多種作用[3-4]。

目前油橄欖葉中橄欖苦苷的傳統(tǒng)提取方法主要采用水提和醇提法，提取物為含量3%～5%的粗制品，該法得率較低、操作費(fèi)時(shí)、能耗大[5-12]。近年來，超聲波輔助提取方法廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中，其主要是利用超聲波的空化效應(yīng)增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，使可溶性活性成分迅速溶出，從而提高提取率，縮短提取時(shí)間，并且避免高溫對(duì)提出成分的影響[13-14]。本實(shí)驗(yàn)利用超聲輔助提取油橄欖葉中橄欖苦苷，采用響應(yīng)面分析(response surface methodology，RSM)多元二次回歸方程來擬合影響因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系[15]，通過對(duì)回歸方程進(jìn)行分析優(yōu)化工藝參數(shù)，為橄欖苦苷提取工藝的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油橄欖葉購于甘肅；橄欖苦苷對(duì)照品(純度≥98%)成都曼思特生物科技有限公司；甲醇(分析純)、乙腈(色譜純) 美國天地公司；高效液相色譜用水為三次蒸餾水。

BS-224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KH-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；1200高效液相色譜儀(配有四元泵及DAD檢測(cè)器) 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 橄欖苦苷的提取

將在60℃干燥至質(zhì)量恒定的油橄欖葉粉碎后過篩(30～40目)，備用。準(zhǔn)確稱取一定量的油橄欖葉粉，加入適量甲醇溶液，稱量，在100W超聲功率下提取一定時(shí)間后，冷卻至室溫，稱量，用甲醇溶液補(bǔ)充缺失質(zhì)量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取3 mL續(xù)濾液，過0.45μm濾膜，待測(cè)，計(jì)算油橄欖葉中橄欖苦苷提取率。

式中：C為橄欖苦苷質(zhì)量濃度/(g/mL)；V為加入甲醇溶液體積/mL；m為油橄欖葉質(zhì)量/g。

固定試驗(yàn)條件提取時(shí)間3 0 mi n、甲醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取功率100W、料液比1∶25(g/mL)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)橄欖苦苷提取率的影響。

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化超聲提取油橄欖葉中橄欖苦苷的工藝條件。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取橄欖苦苷對(duì)照品7.88mg，加甲醇定容至5mL，搖勻，配成質(zhì)量濃度1.576mg/mL的對(duì)照品溶液。分別移取395、315、235、155、80μL用甲醇定容至5mL，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y＝5.593×10-8x(R2＝0.9986)，其中y為橄欖苦苷質(zhì)量濃度/(mg/mL)；x為橄欖苦苷峰面積/(mAU·s)。結(jié)果表明橄欖苦苷在0.025～0.125mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent extend C18(150mm×4.6mm，5μm)；柱溫30℃；流動(dòng)相：乙腈-水(21∶79，V/V)[16]；檢測(cè)波長230nm；紫外檢測(cè)器；流速1mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖1可知，橄欖苦苷提取率在90%甲醇溶劑處出現(xiàn)最大值。油橄欖葉中有很多極性不同的化合物，它們最適合的溶劑極性各不相同。因此，橄欖苦苷的提取率會(huì)隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減小。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.1 Effect of methanol concentration on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

圖2 料液比對(duì)油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

2.1.2 料液比對(duì)橄欖苦苷提取率的影響由圖2可知，隨著提取液使用量的增大，橄欖苦苷的提取率逐漸上升，當(dāng)提取液使用量超過1∶25時(shí)，橄欖苦苷提取率增加甚少。因此選取料液比1∶25。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)橄欖苦苷提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

由圖3可知，橄欖苦苷提取率在30min出現(xiàn)最大值，隨著提取時(shí)間的增加，提取率呈先上升再下降，其原因可能是由于橄欖苦苷超聲提取時(shí)間過長，超聲波引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化降低提取率。因此選擇超聲提取時(shí)間30min。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)橄欖苦苷提取率的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.4 Effect of repeated extraction number on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

由圖4可知，1次提取率為6.70%，2次提取率僅為0.94%，考慮到時(shí)間、成本和能耗損失，故選擇提取次數(shù)為1次。

2.2 響應(yīng)面分析與橄欖苦苷提取工藝的優(yōu)化

選取甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間作為對(duì)橄欖苦苷提取率影響顯著的3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 橄欖苦苷提取響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Variables and their coded levels tested in response surface analysis

表2 橄欖苦苷提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。其中，試驗(yàn)號(hào)1～12是析因試驗(yàn)，而13～15是中心試驗(yàn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。采用Minitab 15軟件，使用未編碼單位對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合結(jié)果見表3，其甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸模型為Y＝7.713＋0.091X1－0.024X2＋0.125X3－0.39X12－0.2X22－0.628X32－0.382X1X2＋0.005X1X3－0.19X2X3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

由表3可看出，根據(jù)P值判斷(P＜0.01時(shí)水平極顯著)，方程二次項(xiàng)和交互項(xiàng)影響明顯，其中二次項(xiàng)更為顯著，一次項(xiàng)影響相對(duì)顯著。說明響應(yīng)值(提取率)的變化相對(duì)復(fù)雜，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。該模型的相關(guān)系數(shù)R2＝2.87724/2.92493＝98.37%，說明此模型與試驗(yàn)實(shí)際擬合較好，試驗(yàn)失擬較小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，在所各取的因素水平范圍內(nèi)，對(duì)油橄欖葉中橄欖苦苷的提取率影響排序?yàn)樘崛r(shí)間＞甲醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。

響應(yīng)面Y對(duì)于因素X1、X2、X3值構(gòu)成的三維空間在二維平面上的等高線圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用。Minitab 15軟件處理得到響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)橄欖苦苷提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of pairwise interactions of three variables on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

模型的響應(yīng)曲面及其等高線直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即是響應(yīng)面的最高點(diǎn)。比較幾個(gè)圖可知，因素X3(提取時(shí)間)、X1(甲醇體積分?jǐn)?shù))對(duì)響應(yīng)值的影響較大，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。單純從橄欖苦苷提取率值的大小考慮，可以求得最適的提取條件為X1＝93.5%、X2＝1∶25、X3＝ 26min，預(yù)測(cè)橄欖苦苷的提取率為7.75%，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值，提取液中橄欖苦苷的提取率為7.83%，與預(yù)測(cè)值相差1.4%。因此，基于響應(yīng)曲面法所得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用超聲法從油橄欖葉中提取分離橄欖苦苷，通過單因素試驗(yàn)，以及3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，建立了提取率與各影響因素之間的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)此二次回歸模型，確定橄欖苦苷的最佳提取工藝參數(shù)：甲醇體積分?jǐn)?shù)93.5%、料液比1∶25、提取時(shí)間26min，在此工藝條件下橄欖苦苷的實(shí)際提取率可達(dá)7.83%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)油橄欖葉中橄欖苦苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最佳工藝參數(shù)，降低工藝操作的盲目性。

[1]林鵬, 王潔雪, 李曉魯, 等. 油橄欖葉中裂環(huán)烯醚萜類化合物的研究進(jìn)展[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 34(5)∶ 999-1002.

[2]高彩霞, 王成章, 陳文英, 等. 油橄欖葉中多酚和黃酮的含量分析[J].生物質(zhì)化學(xué)工程, 2006, 40(4)∶ 4-6.

[3]郝婷, 崔建玲, 趙桂琴, 等. 橄欖苦苷提取分離和藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 27(1)∶ 69-72.

[4]陳千良, 孫文基. 裂環(huán)烯醚萜類化合物研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)藥∶ 植物藥分冊(cè), 2003, 18(2)∶ 58-62.

[5]LEONARDIS A D, ARETINI A, ALFANO G, et al. Isolation of a hydroxytyrosol-rich extract from olive leaves (Olea europaea L.) and evaluation of its antioxidant propertiesand bioactivity[J]. Eur Food Res Technol, 2008, 226(4)∶ 653-659.

[6]黨建章, 黃志立, 張志安, 等. 橄欖葉中橄欖苦苷不同提取方法的研究[J]. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 5(4)∶ 34-36.

[7]RIDA F, SAMER B, SERINE E, et al. The antioxidant and antiproliferative activity of the lebanese Olea europaea extract[J]. Plant Foods Hum Nutr, 2011, 66(1)∶ 58-63.

[8]VALENTINA R G, ROCIO P, ANGEL C. The effect of tyrosol, hydroxytyrosol and oleuropein on the non-enzymatic lipid peroxidation of rat liver microsomes[J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2001, 217(1/2)∶ 35-41.

[9]王成章, 高彩霞, 葉建中, 等. 引種阿斯油橄欖葉中橄欖苦苷提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2009, 29(3)∶ 53-57.

[10]何志勇, 夏文水. 橄欖果實(shí)中酚類化合物的分析研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(26)∶ 406-407.

[11]RYAN D, LAWRENCE H, PRENZLER P, et al. Recovery of phenolic compounds from Olea europaea[J]. Analytica Chimica Acta, 2001, 445 (1)∶ 67-77.

[12]KIRITSAKIS K, KONTOMINAS M G, KONTOGIORIS C, et al. Composition and antioxidant activity of olive leaf extracts from greek olive cultivars[J]. J Am Oil Chem Soc, 2010, 87(4)∶ 369-376.

[13]林健, 陳鋒, 李春來. 橄欖總黃酮的超聲提取工藝研究[J]. 海峽藥學(xué), 2007, 19(11)∶ 60-62.

[14]李張偉, 劉宇輝, 張珠珠. 橄欖黃酮的提取及其抗氧化作用的研究[J]. 廣東化工, 2007, 34(12)∶ 37-40; 89.

[15]任丹丹, 陳谷. 響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵多糖超聲提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(8)∶ 143-146.

[16]黨建章, 許柏球, 徐華順, 等. 高效液相色譜法測(cè)定橄欖葉提取物中橄欖苦苷的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(9)∶ 711-712.

Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction Process for Oleuropein from Olea europaea Leaves by Response Surface Analysis

YAN Shu-jun，WANG Yuan，SU Yan-hong，RAO Zai-sheng，LI Hui*
(College of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Objective∶ To find optimal process conditions for the ultrasound-assisted extraction of oleuropein from Olea europaea leaves. Methods∶ The effects of methanol concentration, solid-to-solvent ratio and extraction time on oleuropein yield were investigated by one-factor-at-a-time design. A three-factor, three-level Box-Behnken experimental design was employed to build a second-order polynomial regression equation. The obtained regression equation was analyzed by response surface analysis to optimize the three process conditions. Results∶ The optimal process conditions were as follows∶ methanol concentration of 93.5%, solid-to-solvent ratio of 1∶25 (g/mL) and an extraction time of 26 min. Conclusion∶ Under these conditions, the oleuropein yield from Olea europaea leaves was up to 7.83%.

Olea europaea leaves；oleuropein；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0073-04

2011-07-08

閆樹軍(1988—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锾崛∨c分離。E-mail：ysj512780817@163.com

*通信作者：李暉(1954—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗帉W(xué)工藝學(xué)。E-mail：Lihuilab@sina.com