楊艷芹，石清芳，唐兆瑞

(甘肅省婦幼保健院病理科，蘭州 730050)

惡性腫瘤對人類的危害極大，其中宮頸癌仍然是危害婦女身體健康的主要疾病之一，亞洲地區(qū)宮頸癌發(fā)病率占世界宮頸癌發(fā)病率的54%，因此做好婦女宮頸癌篩查工作是治療宮頸癌的關(guān)鍵［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴(kuò)增，隨后研究又發(fā)現(xiàn)，端粒酶和一些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其中包括宮頸癌。本研究采用熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)探討了TERC基因在甘肅地區(qū)婦女宮頸病變中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2008年7月—2009年3月在甘肅省婦幼保健院就診的甘肅地區(qū)宮頸病變患者114例，年齡33～71歲，平均年齡49歲。均行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)和陰道鏡檢查，并經(jīng)陰道鏡取活檢，常規(guī)送病理檢查，以病理最高級別為最終診斷。其中部分患者加HPV-DNA檢測。114例患者中宮頸炎22例，CINⅠ35例，CINⅡ14例，CINⅢ18例，宮頸癌25例。取標(biāo)本前所有患者均未進(jìn)行放療、化療及其他特殊治療。

1.2 方法 TCT方法取材，用液基薄層細(xì)胞學(xué)宮頸刷插入宮頸口，在宮頸外口鱗柱狀上皮交界處，以宮頸外口為中心，均勻旋轉(zhuǎn)3～5周，取出宮頸刷置于TCT保存液中備用。GLP TERC/CSP 3探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，按探針試劑盒說明操作。OLYMPUS-BX 51顯微鏡讀取標(biāo)本。FISH 2.0軟件儲存源圖像，分析結(jié)果及建立數(shù)據(jù)庫。

1.3 閾值建立 采集20例宮頸炎患者宮頸細(xì)胞，使用上述方法取材及進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)，每例分析至少100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)2個(gè)以上hTERC信號細(xì)胞數(shù)目的百分比。根據(jù)公式:閾值=平均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(s)計(jì)算閾值。本研究中計(jì)算閾值為6.98%。

1.4 結(jié)果判定 GLP TERC/CSP3探針包含GLP TERC和CSP32種DNA探針，前者雜交到人類3號染色體長臂(3q26.3)，覆蓋整個(gè)hTERC基因，熒光信號為紅色;后者為對照探針，雜交到人類3號染色體3p11.1-q11.1，覆蓋整個(gè)著絲粒區(qū)域，熒光信號為綠色。單個(gè)間期細(xì)胞核中紅色及綠色信號各2個(gè)為正常細(xì)胞;紅色信號大于2個(gè)綠色信號不少于2個(gè)為hTERC基因擴(kuò)增異常細(xì)胞。每例樣本由病理醫(yī)師閱片，隨機(jī)計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算其中異常細(xì)胞的百分比，如果異常細(xì)胞數(shù)的百分比大于閾值，判定為陽性結(jié)果;如果小于閾值，判定為陰性結(jié)果;如果等于閾值，加大觀測樣本細(xì)胞數(shù)目。hTERC異常信號的各種類型記錄為2∶3，2∶4，2∶5，2∶6及以上。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組計(jì)數(shù)資料結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hTERC基因在子宮頸脫落細(xì)胞的陽性表達(dá)情況 隨著宮頸脫落細(xì)胞病變的進(jìn)展，hTERC基因陽性表達(dá)率逐漸增高。表1為病理活檢結(jié)果，宮頸癌組與CIN各組及宮頸炎組中hTERC基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，hTERC基因表達(dá)CINⅡ～Ⅲ組與宮頸炎組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見表1。

表1 TERC基因在子宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 HPV在子宮頸脫落細(xì)胞的表達(dá)情況 見表2。

表2 HPV在子宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況

3 討論

端粒酶是一個(gè)核蛋白酶復(fù)合體，可以在染色體末端增加端粒的重復(fù)序列。人端粒酶由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、人端粒酶RNA(hTR)和一種假尿嘧啶合成酶組成［3］。TERT基因編碼的hTERT是逆轉(zhuǎn)錄酶的催化基團(tuán)，TERC基因編碼的hTR則作為端粒延長的RNA模板，DKC1編碼的假尿嘧啶合成酶是RNA的結(jié)合蛋白。在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，端粒酶的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在正常細(xì)胞中的表達(dá)，這是由于端粒酶的表達(dá)上調(diào)在腫瘤形成過程中起著非常重要的作用。在通常情況下，正常細(xì)胞的分裂會伴隨著穩(wěn)定的端粒長度縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞老化和細(xì)胞分裂周期的停止。而端粒酶的上調(diào)可以維持端粒的長度，使腫瘤細(xì)胞能夠突破正常的增殖限度，逃避細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［4-6］。

從1989年首次在人宮頸癌Hela細(xì)胞中檢測到端粒酶活性至今，國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中端粒酶的陽性率為90% ～100%。宮頸病變時(shí)端粒酶被激活，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變時(shí)即可檢測到端粒酶的表達(dá)，宮頸癌時(shí)激活程度更高，說明端粒酶的激活是宮頸癌病變過程中的早期事件。Rao等［7］于2004年采用比較基因組雜交技術(shù)(CGH)對77例宮頸癌患者進(jìn)行了DNA拷貝數(shù)變化檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3號染色體長臂(3q)的擴(kuò)增是宮頸癌中最常見的基因改變之一，約占54.5%。大量研究發(fā)現(xiàn)，宮頸細(xì)胞由不典型增生向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3q擴(kuò)增。3q的擴(kuò)增常常在重度不典型增生及原位癌中出現(xiàn)，提示此種基因變異與高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為浸潤性癌相關(guān)。許多研究對3q擴(kuò)增(TERC擴(kuò)增)作為一種生物標(biāo)記預(yù)測子宮腫瘤發(fā)生的進(jìn)展進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TERC的擴(kuò)增幾乎在所有高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變(HSIL)中穩(wěn)定出現(xiàn)，也提示TERC可作為對宮頸癌及其癌前病變進(jìn)行檢測的標(biāo)志物［8-9］。

本實(shí)驗(yàn)檢測了甘肅地區(qū)程度不同的宮頸病變宮頸脫落細(xì)胞中TERC基因的擴(kuò)增，研究發(fā)現(xiàn)TERC基因擴(kuò)增的紅色信號在CINⅠ和CINⅡ中主要表現(xiàn)為3個(gè)或4個(gè)，在子宮頸癌中一般均在5個(gè)以上，甚至成巢出現(xiàn)，在CINⅢ中則介于二者之間。本實(shí)驗(yàn)所選取的25例宮頸癌患者，TERC基因擴(kuò)增的紅色信號均為5個(gè)及以上，其中部分宮頸癌患者紅色信號可成巢出現(xiàn)，且陽性擴(kuò)增率為100%;對照組為22例宮頸炎患者，其紅色信號為2～3個(gè)，4個(gè)偶見;35例CINⅠ患者中大部分紅色信號為2～4個(gè)，其中有3例患者紅色信號達(dá)到了5個(gè)或以上;14例CINⅡ患者分為兩部分，一部分紅色信號主要為2～4個(gè)，另外一部分紅色信號達(dá)到5個(gè)及以上;18例CINⅢ患者中，大部分患者的紅色信號均在5個(gè)及以上。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TERC基因的擴(kuò)增可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展，且與病變程度正相關(guān)。

目前臨床常用的宮頸病變篩查方法有HPV檢測、液基薄層細(xì)胞檢測(TCT)等方法，TCT檢測敏感性一般在55% ～80%左右，一旦發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞，特異性可達(dá)到90%以上;HPV檢測雖敏感性高，但特異性一般只在64% ～95%之間，這是由于大多數(shù)HPV陽性的病人可自然轉(zhuǎn)陰，并不導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。因此，二者均存在其局限性。本實(shí)驗(yàn)對部分患者加做HPV檢測，結(jié)果顯示CINⅡ和CINⅢ中HPV陽性率為100%，而TERC基因的擴(kuò)增在CINⅡ和CINⅢ中陽性率則分別為57.1%和72.2%，提示TERC基因檢測的特異性高于HPV檢測。

綜上所述，利用熒光原位雜交方法檢測宮頸脫落細(xì)胞TERC基因的擴(kuò)增情況，同時(shí)，輔助TCT形態(tài)學(xué)檢測和HPV檢測可作為預(yù)測宮頸病變發(fā)展到宮頸癌的有效監(jiān)測指標(biāo)，可以大大提高檢測的特異性和靈敏性，減少形態(tài)學(xué)檢測的假陰性，對宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)及早期治療有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］Parkin D M，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55:74-108.

［2］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58(2):71-96.

［3］Cohen S B，GrahaMME，Lovrecz G O，et al.Protein composition of catalytically active human telomerase froMimmortal cells［J］.Science，2007，315(5820):1850-1853.

［4］Ju Z，Rudolph K L.Telomeres and telomerase in steMcells during aging and disease［J］.Genome Dyn，2006(1):84-103.

［5］Nowak T，Januszkiewicz D，Zawada M，et al.Amplification of hTERT and hTERC genes in leukemic cells with high expression and activity of telomerase［J］.Oncol Rep，2006，16(2):301-305.

［6］Royle N J，Méndez-Bermúdez A，Gravani A，et al.The role of recombination in telomere length maintenance［J］.BiocheMSoc Trans，2009，37(pt 3):589-595.

［7］Rao P H，Arias-Pulido H，Lu X Y，et al.Chromosomal amplifications，3q gain and deletions of 2q33-q37 are the frequent genetic changes in cervical carcinoma［J］.BMC Cancer，2004，4:5.

［8］Hopman A，Theelen W，Hommelberg P P，et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysplasia to invasive cancer［J］.J Pathol，2006，210(4):412-419.

［9］Andersson S，Wallin K L，HellstrMA C，et al.Frequent gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 in cervical adenocarcinomas［J］.Br J Cancer，2006，95(3):331-338.