黃雄昂，葉祥明，林堅(jiān)，劉曉林，李琳

超短波對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和Bcl-2表達(dá)的影響①

黃雄昂，葉祥明，林堅(jiān)，劉曉林，李琳

目的觀察超短波對腦缺血再灌注后大鼠海馬、紋狀體和運(yùn)動皮質(zhì)內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，分為假手術(shù)組、造模組、超短波治療組，每組6只。腦組織切片行免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，觀察TNF-α和Bcl-2在腦組織中表達(dá)的變化。結(jié)果造模組大鼠海馬、紋狀體和運(yùn)動皮質(zhì)TNF-α和Bcl-2的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)；超短波治療組TNF-α表達(dá)低于造模組，Bcl-2表達(dá)高于造模組(P＜0.05)。結(jié)論超短波治療通過影響TNF-α和Bcl-2的表達(dá)對缺血再灌注腦組織產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

腦缺血；缺血再灌注；超短波；腫瘤壞死因子；Bcl-2

[本文著錄格式]黃雄昂，葉祥明，林堅(jiān)，等.超短波對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和Bcl-2表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(5):411-413.

許多研究證明，無熱量超短波治療能改善腦缺血再灌注后血流，減輕腦水腫，提高抗氧化酶含量及降低氧自由基產(chǎn)物[1-4]。本研究探討急性腦缺血再灌注后無熱量超短波對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，為超短波治療的臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康Sprague-Daw ley(SD)大鼠18只，雌雄不拘，由山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量220～270 g；濃縮型鼠抗大鼠TNF-α、Bcl-2單克隆抗體和SABC免疫組化檢測試劑盒均購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 將實(shí)驗(yàn)動物分為假手術(shù)組、造模組、治療組3組，每組6只。假手術(shù)組和造模組術(shù)后不做任何處理，治療組在造模后6 h給予超短波治療。所有大鼠于術(shù)后24 h處死取材。

1.2.2 動物模型制備 應(yīng)用線栓法建立大腦中動脈閉塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型[5]。動物蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)霍納征，提尾右前肢屈曲，或爬行向右側(cè)劃圈者為手術(shù)成功標(biāo)志。假手術(shù)組除不插尼龍線外，其余步驟相同。3組于術(shù)后返回鼠籠喂養(yǎng)。

1.2.3 超短波治療 采用上海電子儀器廠生產(chǎn)的五官超短波治療機(jī)，頻率40.68 MHz，最大輸出功率40W，調(diào)諧后第1檔輸出功率約11W。大鼠固定于特制的塑料固定器內(nèi)，直徑4 cm圓形電極對置于大鼠腦兩側(cè)，電極與大鼠頭部皮膚間隔2 cm，治療時間10m in。

1.2.4 組織切片制備與免疫組織化學(xué)染色 取前囟前2～4mm(運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū))、前囟后3～5mm(海馬區(qū))各厚2mm兩塊冠狀組織塊置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片，片厚4μm。每塊大鼠腦組織均分別制作1張TNF-α和Bcl-2免疫組化染色切片。免疫組化測定采用SABC法，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。陰性對照用0.1 mol/L PBS代替一抗。

1.2.5 免疫組化圖像采集與分析 采用Leica IM 50圖像采集系統(tǒng)對各組免疫組化切片進(jìn)行圖像采集，在各大鼠腦組織切片的海馬(CA1～3)區(qū)、紋狀體區(qū)和運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取6個完整而不重疊的高倍鏡視野(400×)采圖，其中海馬CA 1、CA2、CA 3區(qū)的錐體層各取2個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件對每個視野下陽性反應(yīng)物的平均光密度和陽性面積率進(jìn)行測定。以每例6個視野的平均光密度和陽性面積率的平均值做為該例相應(yīng)區(qū)域的測量值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 造模組及治療組大體檢查均見患側(cè)大腦半球腦水腫明顯，顏色蒼白，腦溝腦回模糊不清，組織較脆，呈豆腐渣樣。

2.2 免疫組化染色 TNF-α和Bcl-2免疫組化染色陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，聚集于神經(jīng)元胞體及軸突，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)纖維網(wǎng)也可見較多陽性顆粒物沉著。假手術(shù)組免疫陽性顆粒染色淺，數(shù)量少；造模組和治療組海馬、紋狀體及運(yùn)動皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞胞漿可見大量深棕色TNF-α和黃色Bcl-2免疫陽性顆粒，其中運(yùn)動皮質(zhì)各層神經(jīng)細(xì)胞均有陽性反應(yīng)，特別是大錐體細(xì)胞和大梭形細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)大量典型的陽性顆粒物。

2.3 圖像分析 與假手術(shù)組比較，造模組不同腦區(qū)TNF-α和Bcl-2平均光密度與陽性面積率都明顯增高(P＜0.01)；治療組TNF-α各腦區(qū)平均光密度和陽性面積率均低于造模組(P＜0.05)，Bcl-2平均光密度均顯著高于造模組(P＜0.001)，海馬及運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)陽性面積率高于造模組(P＜0.05)。見表1、表2。

3 討論

目前認(rèn)為，腦缺血再灌注損傷是多種致病機(jī)制共同作用、互相促進(jìn)的結(jié)果，其中腦組織長時間缺血缺氧造成能量代謝紊亂、神經(jīng)元電活動衰竭、細(xì)胞膜去極化、細(xì)胞膜離子梯度喪失，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡；即使在短時間內(nèi)完全恢復(fù)血供，繼發(fā)性損傷(如神經(jīng)元凋亡、自由基生成增多、鈣超載、興奮性氨基酸堆積、炎性細(xì)胞浸潤等)仍將影響腦組織功能。

表1 各組不同腦區(qū)TNF-α和Bcl-2平均光密度

表2 各組不同腦區(qū)TNF-α和Bcl-2陽性面積率(%)

TNF-α是機(jī)體炎癥和免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，Vila、W ittmann等發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平在腦缺血時增高，且與腦缺血程度、神經(jīng)功能缺損程度、急性腦梗死面積和部位等密切相關(guān)[6-7]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，能抑制多種損傷因子激發(fā)的細(xì)胞凋亡。有研究表明，Bcl-2可調(diào)節(jié)線粒體通透性，抑制細(xì)胞色素C釋放和脂質(zhì)過氧化物的形成，阻止氧化應(yīng)激反應(yīng)，加強(qiáng)線粒體攝取鈣離子的作用，提高線粒體對鈣離子誘導(dǎo)的呼吸鏈損傷的耐受力，從而抑制細(xì)胞凋亡過程[8-9]。

腦梗死的臨床治療強(qiáng)調(diào)超早期改善局部腦組織血液供應(yīng)。超短波能加速血流，擴(kuò)張血管，改善組織器官血液循環(huán)，增加血管壁通透性。

結(jié)合以往對缺血再灌注腦血流量時間窗的研究[10]和超短波的作用特性，在再灌注初期(6 h以內(nèi))腦血流量突然增加，形成所謂高灌注狀態(tài)，此時如給予超短波治療則會進(jìn)一步增加血流，不僅可能造成出血，而且可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重?fù)p傷；而在再灌注6 h以后，血流量降低，形成低灌注狀態(tài)，這時給予超短波治療則可緩解低灌注狀態(tài)，減輕其缺氧缺血，抑制細(xì)胞凋亡，對再灌注損傷起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選擇在造模后6 h進(jìn)行超短波治療，符合以往研究提示的治療時機(jī)。

目前大多數(shù)人認(rèn)為，超短波對腦缺血再灌注損傷的治療作用主要與改善局部腦供血狀態(tài)有關(guān)。此外也有文獻(xiàn)報(bào)道，無熱量超短波的非熱效應(yīng)產(chǎn)生的高頻振蕩，可以使組織中的離子、偶極子、微粒之間的摩擦增加，促使組織各種成分的交換，改變了組織的理化過程，在此作用下出現(xiàn)生長發(fā)育迅速、神經(jīng)纖維再生加速、白血球吞噬作用加強(qiáng)等效果[11]。本研究顯示，超短波能減少缺血再灌注大鼠腦中TNF-α的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，從而減少繼發(fā)性炎性反應(yīng)對腦組織的損害，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生，有助于腦功能恢復(fù)。這一作用機(jī)制是否與非熱效應(yīng)有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。超短波療法對缺血再灌注損傷腦組織有一定的保護(hù)作用，在改善腦血流、治療缺血性腦血管病方面有較好的應(yīng)用前景。但其作用機(jī)制、治療劑量、最佳治療時機(jī)，以及治療中的安全保障等諸多方面仍有待進(jìn)一步研究。

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Effect of U ltrashortW ave Diatherm y on Exp ression of Tum or Necrosis Factor-αand Bcl-2 after Cerebral Ischem ia/Reper fusion in Rats

HUANG Xiong-ang,YE Xiang-m ing,LIN Jian,et al.Department ofRehabilitation Medicine,Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310014,Zhejiang,China

Ob jectiveTo observe the effects of ultrashortwave diathermy on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and Bcl-2 in hippocampus,striatum and motor cortex of ratswith cerebral ischem ia/reperfusion.M ethodsThemodel of focal ischem ia/reperfusion in Sprague-Daw ley ratswas induced with intralum inalm iddle cerebral artery occlusion(MCAO)with nylonmonofilament suture.The ratswere divided into 3 groups:sham group(n=6),model group(n=6)and ultrashortwave diathermy group(n=6).Brain tissue sliceswere immunohistochem ically stained(SABC)to observe the expression of TNF-αand Bcl-2.Resu ltsThe expression of TNF-αand Bcl-2 in left hippocam pus,striatum andmotor cortex was higher in themodelgroup than in the sham group(P＜0.01).The expression of TNF-αwas lower but Bcl-2 was higher in the ultrashortwave diathermy group than in themodel group(P＜0.05).ConclusionU ltrashortwave diathermy can affect the expression of TNF-αand Bcl-2,whichmay associate to the neuroprotection from focal cerebral ischem ia/reperfusion injury.

cerebral ischem ia;ischem ia/reperfusion;ultrashortwave diatherm y;tumor necrosis factor;Bcl-2

R743.3

A

1006-9771(2012)05-0411-03

2012-01-16

2012-04-06)

浙江省人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，浙江杭州市310014。作者簡介：黃雄昂(1978-)，男，浙江遂昌縣人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病康復(fù)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.004