何丹 任鵬亮 范雪嬌 楊曉龍 李俊葓 劉琳 劉戟△

（1.四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)與檢驗(yàn)系，四川 綿陽 621000；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，四川 成都 610041）

食管癌是常見惡性腫瘤，除飲食、環(huán)境因素外，包括乙醇代謝、葉酸代謝、致癌物代謝、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、癌基因在內(nèi)的許多基因都可能與食管癌的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，人類DNA修復(fù)機(jī)制通過保護(hù)基因組免受由內(nèi)外源性因素導(dǎo)致的各種損傷從而保持基因組穩(wěn)定性［1］。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是人類遺傳變異最普遍的形式，各種證據(jù)表明DNA修復(fù)基因特定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)會(huì)影響酶的表達(dá)水平、酶活性以及個(gè)體對DNA損傷的修復(fù)效能，修復(fù)基因缺陷可能導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和癌癥發(fā)生［2－3］，暗示腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體差異與特定修復(fù)基因的多態(tài)性相關(guān)［1］。我們選擇MSH2和MLH1兩個(gè)基因作為錯(cuò)配修復(fù)基因的代表，探討其對食管癌發(fā)生的作用。

錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair gene，MMR）是DNA修復(fù)的幾個(gè)酶系統(tǒng)之一，對保持遺傳信息的完整性和穩(wěn)定性，避免遺傳突變的產(chǎn)生具有重要作用。MSH2基因突變可引起包括結(jié)直腸癌、遺傳性無息肉病、Muir－Torre綜合征等的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)某些食管癌病人MSH2基因嚴(yán)重缺陷，其低水平表達(dá)與食管癌發(fā)生相關(guān)［4］，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSH2基因多態(tài)性可能改變其蛋白功能［5］。MLH1基因突變是以DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為標(biāo)志的大部分散發(fā)性腫瘤的特征之一，并常見于直腸、子宮內(nèi)膜和胃部腫瘤中。此外MLH1基因還參與有絲分裂和減數(shù)分裂的重組事件，與異源雙鏈的校正及細(xì)胞凋亡有關(guān)。但MSH2和MLH1基因與食管癌發(fā)生的關(guān)系尤其是其聯(lián)合作用在中國人群中的研究尚少見報(bào)道。鑒定這些DNA錯(cuò)配修復(fù)酶突變基因型與食管癌發(fā)生的相關(guān)性可能有助于闡明食管癌的病因?qū)W機(jī)制并對該疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測和判斷。因此，我們進(jìn)行了一項(xiàng)基于醫(yī)院的包括169例食管癌病人和132例對照的研究，探究MSH2c.2063T＞G和MLH1IVS14－19A＞G兩個(gè)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所有研究對象均為中國人群，包括2005年4月到2011年6月期間在四川省綿陽市腫瘤醫(yī)院招募的169例經(jīng)組織病理學(xué)確診的食管癌患者（不受年齡、性別、組織學(xué)類型限制，術(shù)前未經(jīng)放射和抗癌藥物治療）和132例無血緣關(guān)系的健康個(gè)體作為正常對照（主要來自于體檢者，并按性別和年齡與病例頻數(shù)配對）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“全血基因組DNA快速提取試劑盒（溶液型）”提取全血基因組DNA。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析

采用PCR體外擴(kuò)增目的基因片段和限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)分析（RFLP）方法檢測目的基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。引物序列設(shè)計(jì)及擴(kuò)增反應(yīng)條件和RFLP所用酶見表1。擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)儀MyGeneTMSeries Peltier Thermal Cycler上進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外光照射下在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。病例組和對照組兩組間的人口特征差異顯著性以χ2檢驗(yàn)所得P值確定。以非條件Logistic回歸分別計(jì)算兩組等位基因及基因型頻率，通過經(jīng)年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史等校正后的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI）評估各種基因型或者基因之間交互作用與食管癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，差異顯著性設(shè)定在P＜0.05。

表1 PCR－RFLP引物序列設(shè)計(jì)及擴(kuò)增反應(yīng)條件和酶切分析結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 人口特征

本研究中共計(jì)301個(gè)樣本，包括169例食管癌患者和132健康人。表2顯示了所研究人群主要特征。在年齡和性別分布上兩組人群沒有明顯差別（P＞0.05），但是吸煙和飲酒在病例組的比例明顯高于對照組，分別是71.0%，59.8%和30.3%，32.6%，表明吸煙和飲酒是食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，這與通常的認(rèn)識(shí)相符，然而在癌癥家族史上兩組沒有明顯差別（P＞0.05）。

表2 病例組（169名）和對照組（132名）研究對象的人口特征分布

2.2 單核苷酸多態(tài)性和食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

表3顯示了MSH2和MLH1基因在食管癌患者組及正常對照組中的等位基因與基因型頻率分布。經(jīng)Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，對照組所有基因型符合遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。在病例組中 MSH2TT，TG和GG基因型頻率分布分別為115（68.1%），34（20.1%）和20（11.8%），與對照組差別極大，分別為122（92.4%），10（7.6%）和0。與野生型TT攜帶者相比，突變雜合子TG和純合子GG更易患食管癌（OR＝5.03，95%CI＝1.99－11.08，P＝0.001）。對于MLH1，病例組中AA，AG，GG基因型頻率分布分別為118（69.8%），48（28.4%）和3（1.8%），與對照組也有一定差別，分別為107（81.1%），24（18.2%）和1（0.7%）。其中突變GG等位基因的攜帶者發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)是AA野生型純合子的2.45倍（OR＝2.45，95%CI＝1.39－47.78，P＝0.030）。

2.3 單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性相互作用和食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

由于癌癥發(fā)生發(fā)展是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的多因素參與的過程，某一通路上的基因可能會(huì)與同一通路上的其它基因作用，甚至可能與其它通路上的某些基因有交互作用，共同調(diào)節(jié)癌癥的易感性?；谙惹把芯?，MSH2和MLH1基因在一定程度上均增加了食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，我們進(jìn)一步探究這兩個(gè)基因之間的相互作用（見表4），發(fā)現(xiàn)MSH2和MLH1共同作用于食管癌的發(fā)生，且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性顯著。表4所示僅攜帶一種突變基因型的人發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常非攜帶者的1.87到2.42倍；攜帶兩種突變基因型的人發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，是正常非攜帶者的14.73倍，這一發(fā)現(xiàn)可能會(huì)對食管癌的發(fā)生提供新的線索。

表3 MSH2和MLH1基因型頻率分布及其與食管癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

表4 聯(lián)合分析MSH2和MLH1多態(tài)性與食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)

3 討論

細(xì)胞DNA容易遭受包括細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)和環(huán)境因素等的一連串打擊造成損傷，通過不同修復(fù)通路可將DNA損傷導(dǎo)致的中毒和突變的影響減到最?。?］。研究表明，DNA修復(fù)能力降低與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［1］。許多DNA修復(fù)基因具有單核苷酸多態(tài)性，導(dǎo)致氨基酸序列替代的SNP可能改變修復(fù)酶的活性，食管癌的發(fā)生發(fā)展，跟所有其他腫瘤一樣，牽涉到包括異常細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)障礙，核受體缺陷等多個(gè)基因突變［7］。在本研究中，我們分析了DNA修復(fù)基因的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn) MSH2c.2063T＞G以及MLH1IVS14－19A＞G與食管癌易患性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)位點(diǎn)均使食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

MSH2作為錯(cuò)配修復(fù)通路上的重要組件，在特定類型的錯(cuò)誤比如新鏈DNA合成堿基配對的錯(cuò)配中起修復(fù)作用。在第13號外顯子第688位密碼子的MSH2c.2063T＞G單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于Walker A基序，這個(gè)基序與ATP酶V型結(jié)構(gòu)域的α和β磷酸基團(tuán)相互作用，是 MSH2修復(fù)活性所必須［8］。研究證明，純化的酵母和人MSH2–MSH6復(fù)合體中這一基序中的突變導(dǎo)致該蛋白與ATP的結(jié)合和水解能力急劇下降［9］，并且在大腸桿菌和酵母中非保守氨基酸的替換導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)能力的下降甚至丟失。這在本研究位點(diǎn) MSH2c.2063T＞G中同樣有可能發(fā)生，隨著非極性疏水性的甲硫氨酸被一個(gè)大的帶正電荷的精氨酸替代，此結(jié)構(gòu)域由于引入了一個(gè)大的正電荷殘基可能會(huì)有結(jié)構(gòu)上的重大改變。在對宿主細(xì)胞再活化分析中，第688位Arg等位基因可能會(huì)與內(nèi)外源性致癌物導(dǎo)致的損傷修復(fù)低能有關(guān)［10］。目前對錯(cuò)配修復(fù)基因MSH2與食管癌關(guān)系的研究主要集中在組織蛋白表達(dá)水平。研究顯示，在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在著MSH2基因的改變，其在組織中的表達(dá)下調(diào)［11］。另有報(bào)道稱該基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化明顯高于正常對照組，且甲基化程度隨疾病進(jìn)展增加，表明甲基化與MSH2基因蛋白表達(dá)缺失相關(guān)，是導(dǎo)致其錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷的重要原因之一［4］。MLH1基因突變是以DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為標(biāo)志的大部分散發(fā)性腫瘤的特征之一，此外MLH1基因還參與有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)的重組事件，與異源雙鏈的校正及細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上證據(jù)均不同程度印證了我們的結(jié)果，但仍需大量樣本量和不同種群人口研究來確證。

MSH2和MLH1多態(tài)性聯(lián)合作用對于食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性使我們推測，有這樣的可能性：兩個(gè)基因在某些水平相互作用共同維護(hù)基因組穩(wěn)定性，它們中的一個(gè)或者兩個(gè)基因缺陷可能會(huì)是食管癌的發(fā)生發(fā)展因素?？傊?，本研究表明MSH2c.2063G和mlH1IVS14－19G等位基因?qū)τ谑彻馨┑陌l(fā)生起到一定作用，并且MSH2和MLH1兩個(gè)多態(tài)性之間的交互作用大大增加了食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，表明修復(fù)基因之間可能存在一定程度的“交流”，即錯(cuò)配修復(fù)基因MSH2和MLH1多態(tài)性間共同作用調(diào)節(jié)各自在食管癌易感性上的致癌效應(yīng)。這一作用果真存在的話，對于食管癌的發(fā)生將是一項(xiàng)新的很有前景的發(fā)現(xiàn)，我們將對此進(jìn)行更深入地研究，為對食管癌發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行更全面的理解、提高篩查效率以及食管癌的治療和預(yù)防將大有裨益。

1 Hiyama T，Yoshihara M，Tanaka S，et al.Genetic polymorphisms and esophageal cancer risk［J］.Int J Cancer，2007，121（8）：1643－1658.

2 Goode EL，Ulrich CM，Potter JD.Polymorphisms in DNA repair genes and associations with cancer risk［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2002，11（12）：1513－1530.

3 Miller KL，Karagas MR，Kraft P，et al.XPA，haplotypes，and risk of basal and squamous cell carcinoma［J］.Carcinogenesis，2006，27（11）：1670－1675.

4 張功員，馬春曉，劉秋亮，等.食管癌組織中hMSH2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測［J］.中華腫瘤雜志，2005，27（9）：541－543.

5 Jascur T and Boland CR.Structure and function of the components of the human DNA mismatch repair system［J］.Int J Cancer，2006，119（9）：2030－2035.

6 Wood RD，Mitchell M，Sgouros J，et al.Human DNA repair genes［J］.Science，2001，291（8）：1284－1289.

7 邢德印，齊軍，譚文，等.北京地區(qū)漢族人群DNA修復(fù)基因XPD單核苷酸多態(tài)性與肺癌及食管癌風(fēng)險(xiǎn)的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2003，20（1）：35－38.

8 Gorbalenya AE，Koonin EV.Superfamily of UvrA－related NTP－binding proteins implication for rational class cation of recombination／repair systems［J］.J Mol Biol，1990，213（4）：583－591.

9 Obmolova G，Ban C，Hsieh P，et al.Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA［J］.Nature，2000，407（7）：703－710.

10 Medina－Arana V，Barrios Y，F(xiàn)ernández－Peralta A，et al.New founding mutation in MSH2associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome on the Island of Tenerife［J］.Cancer Lett，2006，244（2）：268－273.

11 唐郡，閻曉初，彭貴勇，等.食管鱗狀細(xì)胞癌癌組織中hMLH1hMSH2的表達(dá)及其意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，7（11）：1687－1689.