許 勇，諸艷蓉，郟征偉，王 柯，季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

扎沖十三味丸是由石菖蒲、訶子、木香、麝香、沉香等十三味中藥制成的水丸，具有祛風(fēng)通竅，舒筋活血、鎮(zhèn)靜安神等功效。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中已有顯微鑒別、鐵鹽的化學(xué)鑒別項(xiàng)等。為控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，我們建立了用薄層色譜方法鑒別處方中訶子、木香、石菖蒲、沉香四味藥材，氣相色譜法鑒別處方中人工麝香，并采用高效液相色譜法對(duì)處方中石菖蒲的活性成分α－細(xì)辛醚進(jìn)行了測(cè)定，建立的定性、定量方法均簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，紫外－可見(jiàn)光檢測(cè)器，HP6890氣相色譜儀，Chemstation色譜工作站。

1.2 試藥 沉香、石菖蒲對(duì)照藥材及沒(méi)食子酸、去氫木香烴內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、麝香酮、α－細(xì)辛醚對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。樣品:扎沖十三味丸5批，分別由赤峰天奇制藥有限責(zé)任公司、內(nèi)蒙古庫(kù)倫蒙藥廠、內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)有限公司提供，陰性樣品由赤峰天奇制藥有限責(zé)任公司提供。甲醇為色譜純(Merck公司)，其余試劑均為分析純，由中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司提供。

2 鑒別

2.1 訶子的薄層鑒別 取本品5 g，研細(xì)，加乙醇30mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取沒(méi)食子酸對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取按處方比例除去訶子的陰性樣品5 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述三種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯 －甲酸(6∶4∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品液無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 訶子TLC圖譜

2.2 木香的薄層鑒別 取本品1.2g，研細(xì)，加二氯甲烷10mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液。另取去氫木香烴內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品，分別加二氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取按處方除去木香的陰性樣品1.2g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述四種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－環(huán)己烷(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品液無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 木香TLC圖譜

2.3 沉香的薄層鑒別 取2.2項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。另取沉香對(duì)照藥材2.5 g，加石油醚10mL，超聲處理20min，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至約1mL，作為對(duì)照藥材溶液。再取按處方比例除去沉香的陰性樣品1.2g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述三種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯(4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。陰性樣品液無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 沉香TLC圖譜

2.4 石菖蒲的薄層鑒別 取2.2項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。另取石菖蒲對(duì)照藥材0.5 g，加石油醚10mL，浸泡12 h，超聲處理30min，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至約1mL，作為對(duì)照藥材溶液。再取按處方比例除去石菖蒲的陰性樣品1.2g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述三種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚－乙酸乙酯(8∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。陰性樣品液無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

圖4 石菖蒲TLC圖譜

2.5 人工麝香的氣相色譜鑒別 取本品5 g，研細(xì)，加70%甲醇10mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取按處方比例除去人工麝香的陰性樣品5 g，同法制成陰性樣品溶液。再取麝香酮對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1mL含0.05mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。以聚乙二醇(PEG－20M)為固定相的彈性石英毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30 m，起始溫度70℃，以每分鐘10℃的速率升溫至230℃，保持5min。分別取上述溶液各1μL，注入氣相色譜儀測(cè)定。供試品色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰。陰性樣品液無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

圖5 氣相色譜圖

3 α－細(xì)辛醚的含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱:ULTIMATE XB－C18(4.6mm×250mm，5μm);以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速0.8mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):257 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量:10μL，理論板數(shù)按α－細(xì)辛醚峰計(jì)算，不低于8000。結(jié)果樣品中α－細(xì)辛醚與相鄰峰分離度大于1.8，陰性樣品溶液在與α－細(xì)辛醚色譜峰相同位置處無(wú)干擾峰，表明樣品中其他成分對(duì)α－細(xì)辛醚的測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖6。

表1 梯度洗脫表

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取α－細(xì)辛醚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含20 μg的溶液，即得。

圖6 高效液相色譜圖

3.3 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，混勻，取約1.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液20mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取按處方除去石菖蒲的陰性樣品，按3.3項(xiàng)下的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取α－細(xì)辛醚對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為86.1 μg·mL－1的對(duì)照品溶液①和濃度為8.61 μg·mL－1的對(duì)照品溶液②。分別精密吸取對(duì)照品溶液① 0.5μL、1μL、5μL、10μL;對(duì)照品溶液② 5μL、10μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為:Y=4.94X+0.93，r=0.9999(n=5)。結(jié)果表明，α－細(xì)辛醚在4.305～861 ng范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取8.61 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，計(jì)算α－細(xì)辛醚峰面積的RSD為0.1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0、3、6、17、34 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果 α－細(xì)辛醚峰面積的RSD為1.8%。表明供試品溶液在34 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按“3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，α－細(xì)辛醚平均含量為18.37 μg/丸，RSD為1.0%。表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取本品粉末約0.75 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，一式9份，以3份為一組，分別精密加入α－細(xì)辛醚對(duì)照品溶液① 1.2mL、1.0mL、0.8mL，精密加入甲醇20mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，分別用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 α－細(xì)辛醚準(zhǔn)確度試驗(yàn)

3.10 樣品測(cè)定 按上述供試品溶液的制備方法和測(cè)定條件，測(cè)定5批樣品中α－細(xì)辛醚的含量，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 α－細(xì)辛醚樣品測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 木香、沉香、石菖蒲的薄層鑒別 木香中的主要標(biāo)志性成分為木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯。試驗(yàn)中，利用木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯極性小、易溶于三氯甲烷、二氯甲烷等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，采用毒性較小的二氯甲烷做溶劑，超聲提取樣品。為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，沉香、石菖蒲的薄層鑒別，亦采用該供試品溶液進(jìn)行薄層鑒別，得到了滿意的結(jié)果。

4.2 麝香的氣相色譜鑒別方法 處方中的人工麝香為名貴藥材［1］，原標(biāo)準(zhǔn)中并未建立其氣相色譜鑒別，為了控制藥品的質(zhì)量，在試驗(yàn)過(guò)程中，我們研究摸索了麝香的氣相鑒別方法。因本品為水丸，易溶于一定濃度的甲醇溶液，不易溶于乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，因此，在樣品的前處理過(guò)程中，采用70%甲醇超聲提取的方式，但麝香酮對(duì)照品不易溶于70%甲醇溶液，因此采用了乙酸乙酯配制麝香酮對(duì)照品溶液。

4.3 石菖蒲測(cè)定成分的選擇 石菖蒲為天南星科植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)的干燥根莖。具有開(kāi)竅豁痰、醒神益智、化濕開(kāi)胃等功效［1］。石菖蒲含有大量的揮發(fā)油，其主要功效成分有α－細(xì)辛醚和β－細(xì)辛醚［2～4］等，α－細(xì)辛醚和β－細(xì)辛醚是順?lè)串悩?gòu)體，因考慮到β－細(xì)辛醚較不穩(wěn)定，易在特定條件下轉(zhuǎn)化為α－細(xì)辛醚［5］，故最終確定α－細(xì)辛醚為石菖蒲含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

4.4 α－細(xì)辛醚含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行紫外光譜掃描，樣品色譜圖中α－細(xì)辛醚色譜峰的紫外光譜與對(duì)照品一致，在257 nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm。

4.5 α－細(xì)辛醚含量測(cè)定提取方法的選擇 α－細(xì)辛醚的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)已報(bào)道的有氣相色譜法［5］、高效液相色譜法［6］等，但復(fù)方制劑扎沖十三味丸中α－細(xì)辛醚的含量測(cè)定方法未見(jiàn)報(bào)道。在試驗(yàn)中采取回流提取、超聲提取等多種方法進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果超聲處理提取效率最高，故采用超聲處理的提取方式。同時(shí)我們對(duì)70%甲醇、90%甲醇、甲醇、乙醇4種提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果，乙醇的提取效率最低，而隨著甲醇比例的提高，α－細(xì)辛醚的提取效率顯著增加，當(dāng)采用純甲醇進(jìn)行提取時(shí)，α－細(xì)辛醚的提取效率最高。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］郭玫，郭力，董曉萍.石菖蒲中α、β－細(xì)辛醚含量的測(cè)定［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22(4):26 －27.

［3］董小萍，鄧放.石菖蒲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24(1):60 －63.

［4］陳興權(quán)，趙天生，李永昕，等.石菖蒲揮發(fā)油制備α－細(xì)辛醚的研究［J］.精細(xì)化工，2000，17(7):376 －378.

［5］魏立平，吳玫涵.用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定石菖蒲揮發(fā)油中α－細(xì)辛醚和β－細(xì)辛醚的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(1):62 －64.

［6］陳澤彬，陳日來(lái)，陳連劍，等.小兒遺尿分散片中α－細(xì)辛醚的含量測(cè)定［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(11):1－2.