劉佳穆,譚艾娟,呂世明,金志強

摘要：采用微生物法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法同時測定鮮奶中環(huán)丙沙星的殘留，結(jié)果表明： 微生物法適合牛奶收儲時抗菌藥物殘留的初篩；酶聯(lián)免疫法能夠較精確地測定奶中環(huán)丙沙星的殘留，但其費用昂貴，高效液相法適合質(zhì)監(jiān)部門和大型企業(yè)應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：牛奶；高效液相法；微生物法；酶聯(lián)免疫法；殘留檢測

中圖分類號：S859.79+6文獻標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.02.009

Detection of Ciprofloxacin Residue in Milk with Different Methods

LIU Jia-mu 1，TAN Ai-juan1， LV Shi-ming2，JIN Zhi-qiang3

(1. College of Life Sciences, Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025,China;2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang，Guizhou 550025, China；3. Agriculture Committee of Guiyang City, Guiyang ，Guizhou 550081，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: The ciprofloxacin residues in milk were simultaneous determined with the microbial test method, Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The result showed that the microbial test method was suitable for primary screening detection of antibacterial residues in the process of milk collection. The ciprofloxacin residue in milk was determined accurately by the method of ELISA, and the cost of ELISA test was more expensive. The method of HPLC for testing ciprofloxacin residue in milk was accurate and quick, it was suitable for applying in qualitative inspect branch and large enterprise.

Key words: milk; HPLC；the microbial test method；enzyme immunoassay ; residue detection

牛奶是人們尤其是嬰幼兒的主要食品，牛奶中殘留抗菌藥物會危害飲用者的健康[1-2]。近年來，抗菌藥物越來越廣泛地用于牛奶生產(chǎn)，如廣譜的氟喹諾酮類，高效、價廉的青霉素被廣泛用于奶牛疾病和乳房炎的防治[3-4]，因此，牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會的重視。本研究應(yīng)用3種不同方法測定了貴陽市市售鮮奶中環(huán)丙沙星的殘留。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1鮮奶樣品 貴陽市市售生鮮乳24份。菌株：嗜熱乳酸鏈球菌（沈陽森科生物醫(yī)藥有限公司）。

1.1.2藥品色譜級甲醇、色譜級乙腈（天津康巢科技公司），氟羅沙星標(biāo)準(zhǔn)品、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%，上海盛思生化科技有限公司），環(huán)丙沙星檢測試劑盒（美國，R&D Systems公司）；2，3，5一氯化三苯四氮唑（TTC）、氯化銅、稀硫酸、酸化乙腈等均為分析純試劑。

1.1.3儀器Waters600高效液相儀和2876紫外檢測器（美國waters公司），高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），板式酶標(biāo)儀（北京市新風(fēng)技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1微生物法（TTC法）檢測牛奶中抗生素殘留[3-4]嗜熱乳酸鏈球菌液準(zhǔn)備：活化好的嗜熱乳酸鏈球菌接種于已滅菌的脫脂牛奶中，培養(yǎng)15 h，再用滅菌脫脂乳以1∶10的比例稀釋菌液，備用。

抗菌藥物殘留的測定：取5 mL生鮮牛奶，巴氏滅菌，冷卻至37 ℃，加入1 mL菌液，37 ℃水浴2 h，加入TTC試劑100 μL，37 ℃水浴30 min，記錄結(jié)果。結(jié)果判定：樣品顏色變紅為陰性；不變紅為陽性。

1.2.2酶聯(lián)免疫法檢測牛奶中環(huán)丙沙星的含量[7]

（1）樣品前處理。準(zhǔn)確量取5 mL牛奶，4 000 r·min-1離心，棄上層脂肪，待用。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精確配制80，40，20，10，

5，2.5 μg·mL-1的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，按照試劑盒說明書進行測定，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品奶中環(huán)丙沙星測定。按照檢測試劑盒說明書測定環(huán)丙沙星的含量。

1.2.3高效液相法檢測牛奶中環(huán)丙沙星含量樣品前處理：取2 mL牛奶于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，漩渦混合2 min，超聲30 s，振蕩5 min，4 000 r·min-1離心10 min，抽取沉淀和乳脂之間的液體，待用，過C18小柱，用5 mL水和0.5 mL甲醇淋洗，再用流動相1 mL洗脫，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機測定。

色譜條件：流動相0.05 mol·L-1磷酸緩沖液-乙腈（80∶20），波長260 nm，流動相流速0.8 mL·min-1，進樣量20 μL，柱溫25 ℃。

2結(jié)果與分析

經(jīng)TTC法檢測，在24個樣品中，只有1個樣品顏色未發(fā)生變化，陽性率4.2%。酶聯(lián)免疫法檢測出24個樣品中15個樣品含有環(huán)丙沙星，其陽性率62.50%。高效液相檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=30 2 16x+147，R=0.999 9，回收率大于86.9%，檢出率與酶聯(lián)免疫法一致，詳見表1。

結(jié)果表明，TTC法簡單經(jīng)濟，但只能判定奶中抗菌藥物是否超過殘留限量，不能確定抗菌藥物的種類和含量，適合牛奶收儲時抗菌藥物殘留的初篩；高效液相法和酶聯(lián)免疫法能夠進行精確的定量，其中酶聯(lián)免疫法可以快速檢測奶中環(huán)丙沙星的殘留并得出較準(zhǔn)確結(jié)果，但其費用昂貴，不適合大規(guī)模檢測；高效液相法操作快，檢測結(jié)果不僅可以定性，還可以得出準(zhǔn)確含量，但是設(shè)備昂貴，只能為質(zhì)監(jiān)部門和大型企業(yè)采用。

3討論

隨機采取的24份生鮮奶中，環(huán)丙沙星的檢出率為62.50%（16/24），16個陽性樣品中，只有一份奶樣的環(huán)丙沙星殘留超標(biāo)（189.3 ng·mL-1）,其余15份樣品的含量均低于國家規(guī)定的100 ng·mL-1的殘留限量。根據(jù)TTC法的檢測結(jié)果，貴陽市市售生鮮奶中抗生素殘留的陽性率為4.2%，與國內(nèi)其它城市的檢測結(jié)果相比處于中等偏下的水平[8-11]；目前我國牛奶中抗生素殘留的情況并不樂觀，有關(guān)部門應(yīng)加強管理，規(guī)范企業(yè)行為，建立乳制品市場準(zhǔn)入制度[12]，并對牛奶中抗生素殘留進行有效監(jiān)測和監(jiān)控，以保證人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全[13]。

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