王儆等

[摘要]目的：成功構(gòu)建攜帶SFRP2基因的腺病毒載體。方法：從pGBKT-SFRP2質(zhì)粒中擴(kuò)增SFRP2基因，將SFRP2基因亞克隆至質(zhì)粒穿梭載體pAd-Track-CMV。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，成功構(gòu)建的重組腺病毒Ad-SFRP2，確定轉(zhuǎn)染效率。原代培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，利用Ad-SFRP2感染該細(xì)胞。通過RT-PCR和Western Blot分別檢測感染后人瘢痕成纖維細(xì)胞及對照組細(xì)胞中SFRP2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果顯示腺病毒Ad-SFRP2的PCR產(chǎn)物約為904bp，SFRP2 mRNA表達(dá)水平明顯增高；用抗SFRP2多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測為陽性，感染的重組腺病毒載體在人瘢痕成纖維細(xì)胞中SFRP2蛋白有較高的穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建含有人SFRP2基因的重組腺病毒Ad-SFRP2；它可有效提高人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中SFRP2基因的表達(dá)水平。

[關(guān)鍵詞]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞

[中圖分類號]R318[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] [文章編號]1008-6455（2012）11-1981-04

成纖維細(xì)胞作為創(chuàng)傷愈合時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在內(nèi)諸多以過度增生為特征的病變中，常常表現(xiàn)為凋亡抑制，進(jìn)而引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)造成創(chuàng)面修復(fù)失控并最終導(dǎo)致過度纖維化而形成增生性瘢痕[1]。我們過去運(yùn)用從基因芯片中篩選出一個(gè)具有抑制細(xì)胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈顯著高表達(dá)的基因SFRP2[2-3]，該基因可能在增生性瘢痕形成的過程中起著重要作用。但是目前SFRP2調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不明了，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)利用pAd-Easy腺病毒載體系統(tǒng)[4]，通過PCR擴(kuò)增SFRP2基因，克隆到腺病毒載體pAdEasy共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，構(gòu)建攜帶SFRP2基因的重組腺病毒，在體外感染人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞以觀察SFRP2基因表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 材料：pGBKT-SFRP2質(zhì)粒（袁順宗博士惠贈(zèng)）。感受態(tài)菌株及293細(xì)胞株（我院燒傷研究所）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Haclon公司）。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T載體、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000（Takara公司）。Lipofectamine2000（Invitrogen公司）。Trizol及RT-PCR試劑（美國Invitrogen公司）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）。兔抗人SFRP2多克隆抗體（美國CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)：采用組織塊法[6]進(jìn)行增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，具體方法如下：將手術(shù)中取下的增生性瘢痕標(biāo)本仔細(xì)切除皮下脂肪組織和表皮，用加有青霉素和鏈霉素的消毒蒸餾水洗滌3次，再用消毒生理鹽水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中用鋒利的刀片將組織切割成約1mm大小的塊，并接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，待長成致密層以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)所用的是第3～6代的細(xì)胞。

1.2.2 SFRP2編碼序列的擴(kuò)增：采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增人SFRP2基因氨基酸區(qū)域編碼序列的特異性引物，并在引物5'端引入保護(hù)性堿基和限制性酶切位點(diǎn)，其中，上游引物序列為：5'-GAAGATCT ATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列為：5'-TTGTCGAC CTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'（畫線部分分別為BglII和SalI酶切位點(diǎn)）。以pGBKT-SFRP2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系組成為：5μl 10×PCR緩沖液、1μl 10mmol/L dNTPs、pGEX-IL-24重組質(zhì)粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用雙蒸水補(bǔ)足至50μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min，然后用逐步程序94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min完成30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

1.2.3SFRP2重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：2%瓊脂糖凝膠回收SFRP2擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α菌中，藍(lán)白斑初步篩選，挑取單菌落提粒，BglII和SalI雙酶切及PCR鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)BglII和SalI雙酶切，膠回收SFRP2目的片段，與線性化的pAdTrack-CMV載體相連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌，BglII和SalI雙酶切鑒定并進(jìn)行測序。測序正確的重組載體命名為pAdTrack-CMV-SFRP2。PmeⅠ單酶切消化10μg pAdTrack-CMV-SFRP2重組質(zhì)粒，純化回收后獲得線性化載體，然后與0.1μg骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在2.5 kV，200Ω，25μF條件下電穿孔共轉(zhuǎn)化20μl BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性平板37℃培養(yǎng)16 h，挑取針尖大小的克隆，PacⅠ酶切鑒定正確后，再轉(zhuǎn)化DH5α菌中擴(kuò)增。鑒定正確的重組載體命名為Ad-SFRP2，進(jìn)行掃描獲取圖像。

1.2.4 SFRP2重組腺病毒的包裝與制備：按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，取10μgPacⅠ酶切線性化的Ad-SFRP2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后7～10天熒光顯微鏡觀察，根據(jù)綠色熒光蛋白GFP和細(xì)胞病變效應(yīng)判斷病毒產(chǎn)生。收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液重懸，-80℃和37℃反復(fù)凍融4次，12 000 r/min離心10 min，收集病毒上清，-80℃保存，取部分病毒上清液，再次感染HEK293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒，按TCID法測定病毒滴度。

1.2.5 SFRP2重組腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞：原代培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)第3次傳代后，在150 mL/LDMEM中培養(yǎng)24h。將Ad-SFRP2純化病毒按其TCID50值加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，每15min輕搖1次，共4次，4h后換液。

1.2.6 RT-PCR檢測SFRP2表達(dá)水平：按Trizol試劑盒說明書分別提取Ad-SFRP2感染24h后的實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的總RNA。RT-PCR反應(yīng)按照Fermentas反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用PrimerPrimer 5.0設(shè)計(jì)SFRP2的鑒定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。 PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃5 min。以GAPDH作為內(nèi)參照（退火溫度55℃，25個(gè)循環(huán)），GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCA GGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），PCR反應(yīng)結(jié)束后取10μL反應(yīng)產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶。

1.2.7 Western blot檢測SFRP2表達(dá)水平：分別收集感染Ad-SFRP2 24h后和對照組細(xì)胞，提取蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴5min，按照蛋白定量結(jié)果進(jìn)行加樣，行120g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上。NC膜用50g/L脫脂奶封閉1h，加入SFRP2 pAb （1∶500）或GAPDH mAb（1∶1000）工作液，4℃過夜，兔抗人二抗（1∶4000）于室溫下孵育1h，用ECL發(fā)光，膠片顯色，分析結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參照。

2結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果：以pGBKT-SFRP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，大小約904bp，見圖1。

2.2 SFRP2重組腺病毒載體的構(gòu)建：將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD19-T載體，BglII和SalI雙酶切和PCR鑒定確認(rèn)獲得陽性重組克隆（圖2）。進(jìn)而將SFRP2片段亞克隆至pAdTrack-CMV載體，BglII和SalI雙酶切鑒定并經(jīng)測序確認(rèn)獲得陽性重組克隆，命名為pAdTrack-CMV-SFRP2（圖3、圖4）。線性化的pAdTrack-CMV-SFRP2質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183菌中進(jìn)行同源重組，PacⅠ酶切鑒定陽性重組子，可見1條約30 kb的片段和1條4.5 kb的小片段（圖5），表明同源重組成功，獲得SFRP2重組腺病毒載體，命名為Ad-SFRP2。同時(shí)，采用同樣方法，將pAdTrack-CMV空載體與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，重組子命名為Ad-EGFP。

2.3 SFRP2重組腺病毒的包裝擴(kuò)增及鑒定：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞有大量GFP表達(dá)，并可見細(xì)胞變圓呈串珠樣聚集（圖6），裂解粗提物中提取重組病毒DNA，PCR鑒定證實(shí)重組病毒基因組中含有目的基因SFRP2，提示重組質(zhì)粒在293細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。收集病毒液，反復(fù)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞最終得到滴度約為2.0×1010pfu/mL的重組腺病毒。

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果：感染的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中提取mRNA的RT-PCR電泳結(jié)果顯示，以GAPDH為陽性對照，未感染病毒的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SFRP2與感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SFRP2表達(dá)一致。其產(chǎn)物為904bp特異條帶，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后SFRP2基因表達(dá)明顯增高（圖7）。

2.6 Western blot檢測結(jié)果：用SFRP2多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測，以GAPDH為陽性對照，結(jié)果證實(shí)感染重組腺病毒載體在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中SFRP2有較高的穩(wěn)定表達(dá)（圖8）。

3 討論

SFRP2是一個(gè)位于4號染色體q31.3，其全長約2kb，編碼大小約34kD的可溶性蛋白質(zhì)，表達(dá)于胞漿，但也可分泌至胞外發(fā)揮作用。SFRP2蛋白所屬的SFRP家族具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域同源于細(xì)胞表面卷曲受體（Frizzled receptors）的Wnt結(jié)合位點(diǎn)，但是SFRP2缺乏跨膜結(jié)構(gòu)[5]。目前的研究表明，SFRP2通過調(diào)控Wnt信號為主要途徑的方式發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡的作用。表現(xiàn)為：①心肌修復(fù)過程中，SFRP2通過阻斷Wnt3a信號途徑、增加細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)以對抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的凋亡作用，從而調(diào)控心肌細(xì)胞修復(fù)[6]；②胃癌中過表達(dá)的SFRP2通過下調(diào)β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1，cyclin D1，MMP-7等來抑制Wnt信號，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖與凋亡[7]；③乳腺癌中SFRP2主要通過活化NF-κB或抑制JNK信號來發(fā)揮其抗凋亡作用。同時(shí)SFRP2還可以通過與促進(jìn)ECM中的纖維連接蛋白-整合素受體復(fù)合體（fibronectin-integrin receptor complexes）形成從而活化黏附斑激酶（FAK）及其下游信號途徑PI-3K-Akt來抑制細(xì)胞凋亡[8]。

除了抑制凋亡之外，SFRP2對細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)也還具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且SFRP2基因的甲基化被認(rèn)為可用來作為糞便中結(jié)直腸癌的篩選標(biāo)志[9-12]。文獻(xiàn)復(fù)習(xí)還提示SFRP2的高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)締組織生長因子（CTGF）的基因表達(dá)水平增高[6]，而CTGF在HS組織中既可以促進(jìn)Fb增生，又可以促進(jìn)Fb-肌Fb轉(zhuǎn)分化和膠原合成[13]。

綜合上述內(nèi)容，我們認(rèn)為SFRP2在增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中的高表達(dá)其主要作用可能在于引起成纖維細(xì)胞的凋亡抑制，同時(shí)還可能與成纖維細(xì)胞的增殖相關(guān)。根據(jù)既往文獻(xiàn)研究，我們進(jìn)一步推測其調(diào)節(jié)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與Wnt信號相關(guān)，但也不排除還存在著新的信號途徑。然而以上推測尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

本研究構(gòu)建SFRP2重組腺病毒載體，在293細(xì)胞中表達(dá)、包裝、純化病毒后成功構(gòu)建了攜帶SFRP2重組腺病毒。并且初步研究結(jié)果表明該重組病毒在體外能有效感染正常增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，受感染細(xì)胞能高效穩(wěn)定的表達(dá)重組蛋白，為下一步研究SFRP2對病毒自身的復(fù)制與增殖以及宿主細(xì)胞中基因表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過程的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2012-04-04 [修回日期]2012-06-28

編輯/張惠娟