林向飛　閔瑋　朱曉芳　駱丹

[摘要]目的：觀察中波紫外線（UVB）輻射后人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中環(huán)丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimmers，CPDs）的生成和清除情況，以及沒食子兒茶素沒食子酸酯 （epigallocatechingallate，EGCG）干預(yù)對上述過程的影響。方法：以不同劑量UVB照射原代角質(zhì)形成細(xì)胞后并加入EGCG干預(yù)處理，采用免疫組織化學(xué)法檢測UVB照射后不同時段細(xì)胞中CPDs的產(chǎn)生和清除情況。結(jié)果： UVB照射后細(xì)胞中CPDs開始產(chǎn)生，1h左右達(dá)到高峰；CPDs在照光后4h內(nèi)清除速率較快，4h后清除速率逐漸降低，至24hCPDs被基本清除。照光前后加入EGCG干預(yù)減少UVB引起的35.7%～42.9%CPDs產(chǎn)生（P<0.05）。結(jié)論：UVB可明顯引起原代人角質(zhì)形成細(xì)胞損傷，受損程度隨輻射劑量增大而加重；EGCG可以減少UVB輻射所致的光產(chǎn)物的產(chǎn)生，加速光產(chǎn)物的清除。

[關(guān)鍵詞]UVB輻射；人原代角質(zhì)形成細(xì)胞；環(huán)丁烷嘧啶二聚體；EGCG

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1967-04

日光中和皮膚癌相關(guān)的紫外線可以分為UVA（320～400nm）、UVB（280～320nm）、UVC（200～280nm）。UVB可導(dǎo)致DNA的標(biāo)志性損傷即光產(chǎn)物形成[1-2]，包括6-4光產(chǎn)物（（6-4）PPs）和嘧啶或環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）。CPDs約占75%左右，是主要的光產(chǎn)物。這些DNA損傷如沒有修復(fù)或修復(fù)不完善，可以產(chǎn)生基因突變，成為皮膚癌的初始改變。生物體天然固有切除和修復(fù)光產(chǎn)物的能力，這種切除修復(fù)能力會受到多種外界因素如藥物的影響?，F(xiàn)有研究表明綠茶提取物茶多酚（Teapol， TP）中的主要活性成分EGCG具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種作用，既往我們已報道EGCG有較強(qiáng)的抗紫外線能力，但其對UVB輻射后人皮膚原代KC中光產(chǎn)物產(chǎn)生及清除的影響還未見報道[3-6]。本研究主要觀察UVB輻射后人皮膚原代KC中CPDs產(chǎn)生和清除的情況，以及EGCG對上述過程的影響。

1材料和方法

1.1 材料與儀器：EGCG（美國Sigma生物公司）；K-SFM培養(yǎng)基（美國 GIBCO生物公司）；加人中性蛋白酶（Dispase）（美國Sigma生物公司）；CPDs單克隆抗體（美國Sigma生物公司）；免疫組化試劑盒和 DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。SUV-100日光紫外線模擬器及UVB輻照度監(jiān)示器（上海西格瑪高技術(shù)有限公司），EGCG溶液配制濃度為1mg/ml。

1.2 人原代KC的分離與培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)方法[4]，將正常成人環(huán)切術(shù)后的包皮用碘伏浸泡，漂洗3次；剪成0.5cm×0.5cm大小皮片；0.5%中性蛋白酶 4℃下消化16～18h，分離真、表皮；表皮部分用表皮消化液（0.1% 胰蛋白酶：0.01% EDTA=1：1）在37℃下消化10～12min后200目尼龍網(wǎng)過濾，離心，加入K-SFM培養(yǎng)基于37 C、5% CO2下培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞以調(diào)整濃度為1×106/ml，定量接種于直徑3.5cm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至70%～80%融合時用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞爬片：將24mm×24mm的蓋玻片泡酸、沖洗、烘干、消毒備用。將原代KC調(diào)整其濃度為1×106/ml，將無菌蓋玻片放入6孔板中，每張滴加0.6ml細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞80%融合后進(jìn)行EGCG干預(yù)處理及UVB照射。

1.4 UVB照射及EGCG干預(yù)處理：將原代KC分為對照組、時間組、劑量組和EGCG處理組。時間組以30mJ/cm2UVB照射，照光后1h、4h、8h、12h及24h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；劑量組接受不同劑量（30、60和90mJ/cm2）UVB輻射，輻射后4h進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)；EGCG組以30mJ/cm2UVB輻射，照光前4h及照光后加入200μg/ml EGCG與細(xì)胞共孵育，4h后進(jìn)行檢測。每組設(shè)3個平行培養(yǎng)孔。UVB輻照劑量=UVB輻照度×?xí)r間（s）。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測CPDs：按說明書進(jìn)行操作。蓋玻片以丙酮液固定，滴加1：1000稀釋的鼠抗人CPDs單抗，以DAB顯色及蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明及封片后顯微鏡下觀察拍照。陽性細(xì)胞為胞核棕黃色著色，連續(xù)觀察5～10個高倍視野（×400），計數(shù)200個細(xì)胞總數(shù)的陽性細(xì)胞數(shù)， 采用u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1 UVB輻射導(dǎo)致人原代KC中CPDs生成：如圖1A到圖1C所示，UVB輻射可以損傷細(xì)胞，引起光產(chǎn)物產(chǎn)生，我們采用免疫組織化學(xué)法檢測CPDs的產(chǎn)生情況，有CPDs生成的細(xì)胞在圖中表現(xiàn)為具有棕褐色細(xì)胞核的陽性細(xì)胞。有下圖可見，UVB照射后，出現(xiàn)了大量CPDs陽性細(xì)胞，而與照光組相比，非照光組和對照組（以PBS代替一抗作為陰性對照）均未見到陽性細(xì)胞。

2.2 UVB輻射后24h內(nèi)細(xì)胞光產(chǎn)物產(chǎn)生和清除情況：原代KC接受UVB輻射后24h內(nèi)在不同時間點(diǎn)（0、1、4、8、12和24h）檢測CPDs的產(chǎn)生和清除情況，顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)，見表1。胞核彌漫性棕褐色著色為陽性細(xì)胞，連續(xù)觀察5～10個高倍視野（×400），計數(shù)200個細(xì)胞總數(shù)中的陽性細(xì)胞數(shù)。從圖2A到圖2G中可以看出UVB輻射后光產(chǎn)物產(chǎn)生量逐漸增多，1h左右達(dá)到高峰；同時細(xì)胞也開始清除光產(chǎn)物，輻射后4h內(nèi)清除速率較快，輻射后4～24h清除速率逐漸降低，最終光產(chǎn)物被基本清除；各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表1。

2.3 UVB照射劑量對細(xì)胞損傷的影響：原代KC進(jìn)行細(xì)胞爬片，然后接受不同劑量（0、30、60、90mJ/cm2）UVB照射，4h后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。從圖3A到圖3C可以看出，30mJ/cm2UVB照射后鏡下的陽性細(xì)胞最少， 60mJ/cm2 UVB對細(xì)胞的損傷作用增大，陽性細(xì)胞數(shù)增多；90mJ/cm2 UVB損傷作用最強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)最多，這顯示UVB對原代KC的損傷作用呈劑量依賴性，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表2。

2.4 EGCG對UVB輻射后光產(chǎn)物的產(chǎn)生和清除的影響：從圖4A到圖4C可以看出，UVB輻射前后加入EGCG處理細(xì)胞，細(xì)胞的損傷均較單純照射組輕，表現(xiàn)為光學(xué)顯微鏡下的陽性細(xì)胞均較單純照射組少。結(jié)果表明EGCG能夠減輕UVB輻射對細(xì)胞的損傷，既能減少光產(chǎn)物的產(chǎn)生，也可以加快光產(chǎn)物的清除，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表3。

該資料符合Possion分布，對數(shù)據(jù)進(jìn)行u檢驗(yàn)。uEGCG+UVB組>1.96，P<0.05，uUVB+EGCG組>1.96，P<0.05，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3討論

UVB（280～320nm）誘發(fā)紅斑和日曬傷，并與皮膚癌密切相關(guān)[7]。表皮細(xì)胞DNA直接吸收UVB的能量而產(chǎn)生光損傷。環(huán)氧嘧啶二聚體（CPDs）是最主要的DNA光損傷形式[8]，可以導(dǎo)致基因突變?nèi)鏑→T或CC→TT轉(zhuǎn)換，成為皮膚癌的初始突變。皮膚細(xì)胞有多種DNA修復(fù)途徑，可以依據(jù)紫外線介導(dǎo)不同損傷的類型來去除DNA損傷。UVB輻射產(chǎn)生的CPDs主要由核苷酸切除修復(fù)（NER）[9]。

茶多酚是綠茶提取物，其主要有效單體成分為沒食子兒茶素沒食子酸酯 EGCG，它有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抗突變、抗腫瘤形成、抗炎抗病毒及清除自由基和抗氧化等[10]。研究證實(shí)，服用綠茶或其提取物（GTP，EGCG）可抑制多種腫瘤的產(chǎn)生[11]。本部分以原代KC為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法來觀察和檢測UVB輻射后原代KC中CPDs的產(chǎn)生和清除情況。我們分別檢測了照光后不同時間點(diǎn)的CPDs陽性細(xì)胞數(shù)量以動態(tài)分析CPDs的產(chǎn)生與清除過程，同時還檢測了不同紫外線強(qiáng)度以及加入EGCG干預(yù)條件下CPDs生成量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UVB輻射可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，產(chǎn)生CPDs，照光后1h左右達(dá)到高峰。同時細(xì)胞自身也清除光產(chǎn)物，在開始的4h內(nèi)清除速率較快；輻射后4h到24h，CPDs清除速率減慢。我們同時也觀察了不同劑量（30、60、90mJ/cm2）UVB對細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表明隨著UVB輻射劑量的增大，陽性細(xì)胞數(shù)目增多，顯示出UVB對原代KC的損傷作用呈劑量依賴性，UVB輻射強(qiáng)度越大，CPDs產(chǎn)生越多；然而，隨著UVB劑量的進(jìn)一步增大，可能導(dǎo)致細(xì)胞直接壞死或凋亡，而不反映為CPDs產(chǎn)生增加，對此我們將在進(jìn)一步研究中進(jìn)行觀察和分析。照光前后加入EGCG與細(xì)胞共同孵育，鏡下陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于UVB照射組，這證實(shí)了EGCG的光保護(hù)作用，它可以抵抗紫外線，減少CPDs的產(chǎn)生。UVB輻射后立即分別加入EGCG溶液，與細(xì)胞共同孵育4h后進(jìn)行檢測，光學(xué)顯微鏡下陽性細(xì)胞數(shù)也明顯少于UVB照射組，顯示出EGCG可以加快光產(chǎn)物的清除，對細(xì)胞有光保護(hù)作用。

總之，UVB輻射可以導(dǎo)致原代KC的DNA損傷，產(chǎn)生光產(chǎn)物（CPDs）。輻射后細(xì)胞對光產(chǎn)物的清除存在快速清除期（0～4h），以及隨后的慢速清除期（4～24h）。細(xì)胞損傷的程度與UVB輻射的劑量存在著密切關(guān)系，隨劑量增大而加重。UVB輻射前后加入EGCG可以減少光產(chǎn)物的產(chǎn)生和加快光產(chǎn)物的清除。

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[收稿日期]2012-06-25 [修回日期]2012-08-20

編輯/張惠娟