魏杰 張玲 馬振華 聶竹蘭 高澤霞

摘?要：本文采取寶生物公司RNAiso plus試劑從寬口裂腹魚肌肉、腦、腎臟、肝臟、腸、性腺、心臟中提取總RNA，分析了所提寬口裂腹魚不同組織總RNA的質(zhì)量高低，及造成質(zhì)量不同的具體原因，旨在為其他科研工作者在分析RNA質(zhì)量時(shí)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：寬口裂腹魚?組織?總RNA

中圖分類號(hào)：Q52 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2012）10（a）-0019-03

寬口裂腹魚（Schizothorax eurystomus

（Kessler））屬鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬[1]，分布于新疆塔里木河水系阿克蘇河（庫(kù)馬力克河、托什干河、阿克蘇河）、渭干河（木扎提河、克孜爾河、渭干河、克孜爾水庫(kù)、東方紅水庫(kù)）、葉爾羌河（塔什庫(kù)爾干河、葉爾羌河、提孜那普河），是塔里木河水系的土著魚類[2]。隨著新疆水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，塔里木河土著魚類的研究項(xiàng)目呈上升趨勢(shì)，尤其在土著魚類基礎(chǔ)生物學(xué)方面，研究較多[3-5]。但對(duì)于土著魚類分子生物學(xué)方面，僅見于扁吻魚、塔里木裂腹魚及斑重唇魚線粒體DNA部分序列片段與基礎(chǔ)遺傳多樣性方面的研究[6-7]。而對(duì)于塔里木河土著魚類中寬口裂腹魚的分子生物學(xué)方面尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)主要探討了寬口裂腹魚不同組織總RNA提取與質(zhì)量，分析了不同組織所提RNA質(zhì)量高低及其出現(xiàn)差異的原因。RNA分離提取是分子生物學(xué)研究的基本內(nèi)容，也是功能基因組學(xué)研究技術(shù)的重要基礎(chǔ)。因此，寬口裂腹魚不同組織總RNA提取和純化的研究對(duì)于寬口裂腹魚cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，Northern雜交分析，定量PCR以及利用mRNA差異顯示技術(shù)篩選感興趣的相關(guān)基因等提供科技支撐。

1材料與方法

1.1材料

寬口裂腹魚由拜城縣漁民采用三層拉網(wǎng)于黑英山段黑孜爾河捕獲。平均體長(zhǎng)17.8cm，暫養(yǎng)在玻璃缸內(nèi)。

1.2玻璃器皿及塑料制品的處理

一次性塑料制品均在0.1%的DEPC水中

浸泡過夜，之后高壓蒸汽滅菌（121℃30min）。普通玻璃和金屬器皿于180℃干烤8h以上。用于RNA電泳的電泳槽先用去污劑洗干凈，雙蒸水沖洗，自然干燥后，用滅菌的0.1% DEPC浸泡24h。

1.3試劑

DEPC（焦碳酸二乙酯）、RNAiso Plus（寶生物公司（大連））、6×Loading buffer、氯仿、異丙醇、無水乙醇、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）堿、冰醋酸。

1.4方法

準(zhǔn)備工作：DEPC水（DEPC：ddH2O = 1：10000）浸泡所要使用的槍頭和EP管（1.5ml）過夜，然后經(jīng)高壓滅菌后回收滅過菌的DEPC水①以制備1×TAE緩沖液；同時(shí)預(yù)留部分未浸泡過槍頭和EP管且稀釋過的DEPC水②，同樣滅菌后于-20℃保存以備溶解RNA。

（1）活體取樣，取0.1g左右寬口裂腹魚肌肉、腦、腎臟、肝臟、腸、性腺、心臟放入加有1ml的RNAiso Plus（寶生物公司（大連））的EP管，待所取樣本全部完成后再進(jìn)行勻漿，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作在冰浴上進(jìn)行，以免RNA降解。

（2）將（1）中組織倒入已滅菌的5mL組織勻漿器中，同時(shí)加入0.6～1.0mL的RNAiso Plus和0.4～0.6mL的DEPC水，然后在冰上勻漿至無顆?；蛎黠@組織塊。

（3）將上述勻漿液裝入新的1.5mL EP管中（一般可裝兩管），冰上靜止5min左右，然后≥12000rpm，4℃離心5min。

（4）取上清液于新的1.5mL EP管中，每管取0.5mL即可，然后加入1/5 RNAiso Plus體積的氯仿，即0.4mL，加入氯仿后需立即用手劇烈振蕩15s以混勻。

（5）充分混勻后（無分相現(xiàn)象），≥12000rpm，4℃離心15min，即會(huì)分層：上層清液，中層為白色蛋白質(zhì)，下層為帶鮮紅色的有機(jī)相。

（6）取0.6mL上清液于新的1.5mLEP管中，并加入等體積的異丙醇，然后充分混勻，冰上靜止10min，≥12000rpm，4℃離心10min。

（7）棄上清液，此時(shí)可見管底有白色沉淀，切勿將其傾倒，而后沿壁緩慢加入1.0mL經(jīng)冷處理過75%乙醇（RNase-free），清洗沉淀，≥12000rpm，4℃離心5min。

（8）小心棄去乙醇，盡量除盡乙醇，然后室溫干燥5min左右，切莫離心或者加熱；加入20～50μl的RNase-free water（即DEPC水，上標(biāo)為②）溶解，待完全溶解后-80℃保存。

（9）總RNA的濃度及純度測(cè)定

核酸蛋白測(cè)定儀：測(cè)定RNA溶液的吸光值，比較A260/A280的值，保證其在1.8～2.2為比較合適的值；同時(shí)測(cè)定其濃度（取1ul樣品于50μL滅菌的0.1%DEPC水中，再用biophotometer蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定A260及A280值。RNA純度按A260/A280之比值判斷；RNA濃度=樣品濃度×50μL）。

（10）瓊脂糖電泳檢測(cè)

所用瓊脂糖凝膠及電解液均用DEPC處理過的水配制（上標(biāo)為①），電泳檢核糖體RNA的28s、18s和5.8s。

2結(jié)果與分析

2.1樣品的濃度與純度

經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定：肝臟，心臟，肌肉2，肌肉的A260/A280值在1.8～2.2；肝臟、腦和腸的樣品濃度均較高，但是腦和腸A260/A280值小于1.8；心臟2和腎臟2的樣品濃度較低，A260/A280值亦小于1.8，具體見表1。

核酸蛋白測(cè)定儀260nm的讀數(shù)用于測(cè)定DNA或RNA的濃度，280nm的讀數(shù)用于測(cè)定DNA或RNA的純度[8-9]，由表1結(jié)果可知：

（1）肝臟，心臟，肌肉2，肌肉的樣品較純。

4個(gè)樣品以肝臟的濃度最高，可用后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。肌肉2、肌肉與心臟的樣品濃度較低，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因在于，肌肉組織相對(duì)于肝臟要堅(jiān)韌，本次實(shí)驗(yàn)勻漿時(shí)沒有充分研磨；若研磨時(shí)間過長(zhǎng)RNA會(huì)降解，研磨時(shí)間不足，RNA提取量少。而心臟組織大小與魚體大小有關(guān)，魚體偏小，心臟亦小，在勻漿過程中，對(duì)于靜脈竇及動(dòng)脈球部分難于磨碎，所以樣品濃度偏低。

（2）腦、腸的樣品濃度較高；心臟2和腎臟2的樣品濃度較低。

它們的A260/A280值均小于1.8，表示存在蛋白質(zhì)的污染，這是由于實(shí)驗(yàn)過程中用槍頭吸取水相的過程中，用力過大，將中間的蛋白層吸入，使蛋白質(zhì)混入RNA提取液中。腦和腸需進(jìn)一步純化才能用于后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.2樣品總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳

從泳道中的亮帶可以看出，本次電泳時(shí)間（20min）過長(zhǎng)，其中的28s和18s有亮帶處rRNA的比率不是2：1[10]。泳道1（肌肉）、4（肝臟）、5（腦）、7（腸）、8（腦2）、9（肌肉2）和 10（心臟2）均可見三條清晰亮帶28S、18S和5S，但其中的28srRNA處的亮帶不是最亮，說明有部分RNA降解；在泳道4、5、8中5s處最亮，說明降解的較多。

泳道2（腎臟）則無亮帶，說明腎臟的RNA完全被降解，造成這種后果的原因有多種：①取樣時(shí)間過長(zhǎng)，或者樣品保存不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)胞組織壞死；②勻漿時(shí)間過長(zhǎng)，空氣中的RNase進(jìn)入勻漿管中，RNA降解；③勻漿不夠徹底，細(xì)胞未破碎，RNA無法從細(xì)胞中游離出來；④在加入氯仿后，未及時(shí)振蕩EP管中的樣品，使得DNA，RNA，蛋白質(zhì)無法分開；具體原因有待進(jìn)一步研究。

泳道3（性腺）在5s處有亮帶，而且很寬，18s和28s則完全看不見，說明這個(gè)電泳RNA完全降解了，全部降解成5S大小的片段，嚴(yán)重降解的片段往往是和5s大小近似。因此在跑電泳的時(shí)候，就會(huì)在5s處重疊。但是這個(gè)降解是提取操作不當(dāng)而降解還是電泳過程中降解的，還需進(jìn)一步探究。

泳道6（心臟）沒有出現(xiàn)28s，28srRNA降解為18srRNA。泳道11（腎臟2）在28s和18s處有亮帶，沒有出現(xiàn)5s，可能有DNA污染，或者是異丙醇沒有混合均勻?qū)е?，不?huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體見圖1。

綜上分析：寬口裂腹魚不同組織RNA提取后經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)知：肝臟、心臟、肌肉和肌肉2，A260/A280在范圍1.8～2.0之間，說明樣品提取的比較純；但樣品腦，腸，心臟2和腎臟2的A260/A280均在1.8以下，表示受到蛋白質(zhì)污染，需要純化樣品；心臟、肌肉和肌肉2的樣品濃度均較低，但是它們的A260/A280卻在1.8～2.0之間，說明樣品未受污染，只是某些組織中本來RNA含量就少，或研磨時(shí)間不足。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)知：肌肉、肝臟、腦、腸、腦2、肌肉2、心臟2都可以看見明顯的亮帶，說明樣品比較純，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而腎臟和性腺的RNA完全降解則不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

綜合核酸蛋白測(cè)定儀與1%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果，本次采用RNAiso Plus試劑，在肝臟中所提取的總RNA質(zhì)量高，效果好，可以用于進(jìn)一步的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，目的基因的克隆與表達(dá)，Northern雜交分析以及利用mRNA差異顯示技術(shù)篩選。

3結(jié)語(yǔ)

目前，RNA提取方法有多種，Chirgwin[11]等采用異硫氰酸胍/氯化銫法成功獲得收率和品質(zhì)均較高的RNA，但該方法操作繁瑣。Feramisco[12]等介紹了硫氰酸胍/熱酚法獲得高質(zhì)量RNA。Logemann[13]等采用氯化胍法分離了植物組織中的RNA。Cathala[14]采用氯化鋰/異硫氰酸胍法獲得了既有活性又較完整的RNA。謝保勝[10]、吳旭東[15]等采用異硫氰酸胍法提取了可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的斑馬魚和黃河鯰的總RNA，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)在Chomczynski[16]等提出的一步法基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，該方法該法與（異）硫氰酸胍/氯化銫法超速離心法相比，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)，能同時(shí)迅速地處理多個(gè)標(biāo)本，且RNA的完整性與純度均很高；但該法不適合從富含甘油三酯的脂肪組織中提取RNA，而且有時(shí)RNA會(huì)帶有多糖和蛋白多糖的污染，這些污染將影響乙醇沉淀后RNA的溶解，同時(shí)抑制RT-PCR反應(yīng)，并通過結(jié)合到膜上而影響RNA雜交中的印跡步驟。

本課題組則采用大連寶生物公司的RNAiso Plus試劑對(duì)寬口裂腹魚不同組織總RNA提取量及其質(zhì)量進(jìn)行了初步分析。RNAiso Plus試劑采用劇烈的蛋白變性劑，能夠抑制RNA酶活性，還能有效地解離核蛋白與核酸的復(fù)合體，是獲得高純度RNA比較理想的方法[17]，但是在提取寬口裂腹魚總RNA時(shí)，質(zhì)量并不高，主要原因在于：

（1）沒有RNA專用操作區(qū)，公共實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)人員較多，來回走動(dòng)，影響RNA提取質(zhì)量。

（2）本次RNA提取時(shí)間是在夏季，天氣炎熱，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)沒有空調(diào)極易受汗液污染。

（3）在勻漿器中加入RNAiso Plus試劑后，研磨時(shí)間短，細(xì)胞未破裂，導(dǎo)致心臟、肌肉和肌肉2等組織所提RNA量不足。

（4）加氯仿劇烈震蕩分層后，操作者在用移液器移取上清液時(shí)用力過大，吸入了中間有機(jī)相的蛋白質(zhì)層，使腦，腸，心臟2和腎臟2等組織所提RNA受到蛋白質(zhì)污染。

（5）電泳時(shí)間一般用8min，本次電泳時(shí)間過長(zhǎng)（20min），造成RNA降解，使其中的28srRNA電泳條帶不呈最亮，28s和18s有亮帶處rRNA的比率亦不是2：1。

通過實(shí)驗(yàn)，得出以下6點(diǎn)建議。

（1）要有RNA專用操作區(qū)，應(yīng)保持清潔，并定期除菌；離心機(jī)、自動(dòng)移液器、試劑等應(yīng)專用。

（2）用于RNA實(shí)驗(yàn)的玻璃器皿清潔后于180℃干熱滅菌8h；塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡過夜，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后于80℃烘箱中干燥。

（3）實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)戴一次性口罩和橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及汗液中的RNase污染實(shí)驗(yàn)器材。

（4）實(shí)驗(yàn)人員避免說話或來回走動(dòng)，以免唾液與空氣中的RNase污染。

（5）配制溶液用的酒精、異丙醇等均采用未開封的新瓶，溶液需用滅菌的DEPC水配制。

（6）DEPC（焦碳酸二乙酯）在提取RNA的過程中，可用來抑制RNase的活性。

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