雷偉俠 黃安群 范志雄 江瑩芬 榮松柏 李強(qiáng)生 段曉麗 陳鳳祥

摘要：定向誘導(dǎo)基因組局部突變（ＴＩＬＬＩＮＧ）技術(shù)是反向遺傳學(xué)中研究功能基因的一種全新的方法。ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)借助高通量檢測(cè)手段，快速有效地從突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變。系統(tǒng)介紹了ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的基本原理和技術(shù)路線(xiàn)，同時(shí)總結(jié)了ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)本身有待解決的一些問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：定向誘導(dǎo)基因組局部突變（ＴＩＬＬＩＮＧ）技術(shù)；反向遺傳學(xué)；點(diǎn)突變；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｑ７８１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）03－0445-05

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ＴＩＬＬＩＮＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＬＥＩ Ｗｅｉ－ｘｉａ１，ＨＵＡＮＧ Ａｎ－ｑｕｎ２，ＦＡＮ Ｚｈｉ－ｘｉｏｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｙｉｎ－ｆｅｎ１，ＲＯＮＧ Ｓｏｎｇ－ｂｏ１，

ＬＩ Ｑｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＤＵＡＮ Ｘｉａｏ－ｌｉ１，ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ－ｘｉａｎｇ１

（１． Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｎｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｅｆｅｉ ２３００３１， Ｃｈｉｎａ：

２． Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００１１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ａ ｎｏｖｅ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｈａｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｔｈｅ ＴＩＬＬＩＮＧ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇy ａｎｄ ｉｔｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｕｔｉｎｅ were introduced． Meanwhile， ｓｏｍｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ＴＩＬＬＩＮＧ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）； ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ； ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

誘導(dǎo)突變一直是遺傳學(xué)發(fā)展的主要?jiǎng)恿χ?。在各種誘變方法中，化學(xué)誘變應(yīng)用特別普遍?；瘜W(xué)誘變劑中的烷化劑類(lèi)能與核苷酸結(jié)合，從而造成互補(bǔ)堿基的錯(cuò)配，進(jìn)而引起復(fù)制后的堿基系列改變。例如ＥＭＳ（甲基磺酸乙酯）使鳥(niǎo)嘌呤（Ｇ）烷基化，生成Ｏ６－鳥(niǎo)嘌呤，后者能與胸腺嘧啶（Ｔ）配對(duì)而不再與胞嘧啶（Ｃ）配對(duì)［１］。適宜濃度的ＥＭＳ誘變具有染色體斷裂較少（染色體斷裂可引起突變體染色體非整倍化、不育甚至顯性致死）、點(diǎn)突變頻率高的優(yōu)點(diǎn)，因此ＥＭＳ的誘變效果通常比較好［１，２］。

化學(xué)誘變劑處理后產(chǎn)生的突變多為點(diǎn)突變，其中發(fā)生在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的突變可分為三類(lèi)：無(wú)義突變、沉默突變、錯(cuò)義突變。對(duì)于功能基因而言，ＥＭＳ誘導(dǎo)的點(diǎn)突變可產(chǎn)生靜息基因（ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ或ｓｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ）、條件型等位基因（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅ）或只影響特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所有這些突變型對(duì)闡釋目標(biāo)基因的功能非常有益［３］。

隨著大規(guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)的積累，科學(xué)家們對(duì)基因組的注意力從基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向基因的功能，而這就依賴(lài)于反向遺傳學(xué)的發(fā)展［４］。反向遺傳學(xué)研究方法常分為兩類(lèi)，一是特定目標(biāo)位點(diǎn)的定向誘變，另一個(gè)就是全基因組范圍內(nèi)的誘變和篩選。前者常用反義ＲＮＡ抑制或ＲＮＡ干擾（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）來(lái)實(shí)現(xiàn)，后者常用Ｔ－ＤＮＡ隨機(jī)插入或轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法來(lái)實(shí)現(xiàn)［５］。但是，要獲得并分析基因組中每個(gè)基因的敲除突變體并不容易。目前，對(duì)ＲＮＡｉ的研究十分熱門(mén)，然而ＲＮＡｉ的功效仍舊不明朗，主要表現(xiàn)在后代表型的多樣性及不可預(yù)見(jiàn)性。同時(shí)，由于上述技術(shù)均依賴(lài)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng)，需耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)技術(shù)，作為常規(guī)方法加以應(yīng)用目前僅限于少數(shù)物種。當(dāng)然，還有一些其他研究方法，但都存在不少問(wèn)題（表１）。因此，在擬南芥等模式生物測(cè)序完成后，迫切需要一種新的兼具自動(dòng)化、適用性廣、突變率高的反向遺傳學(xué)工具用于功能分析。ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)就是在這一背景下應(yīng)運(yùn)而生的［６］。

１ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的原理

ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）技術(shù)是美國(guó)華盛頓Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ癌癥研究中心以Ｓｔｅｖｅｎ為首的科學(xué)家發(fā)展建立的［７］，它將誘發(fā)產(chǎn)生高頻率點(diǎn)突變的化學(xué)誘變方法與ＰＣＲ篩選技術(shù)和高通量檢測(cè)方法有效結(jié)合，以便發(fā)現(xiàn)、分析目標(biāo)區(qū)域點(diǎn)突變，是一種全新的高通量、低成本的反向遺傳學(xué)研究方法。

ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的原理是先用化學(xué)誘變劑誘發(fā)產(chǎn)生一系列的點(diǎn)突變，再根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，而后將ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物變性退火生成錯(cuò)配的異源雙鏈核酸分子，利用儀器分析技術(shù)區(qū)分出純合雙鏈和異源雙鏈。為了增加通量，避免假陽(yáng)性，它將突變?nèi)后w若干個(gè)個(gè)體樣本的ＤＮＡ混合建池（如擬南芥ＡＴＰ項(xiàng)目組用８?jìng)€(gè)單株建成８倍池），在檢測(cè)出含突變體的混合池后再對(duì)該池中的每個(gè)個(gè)體分別重新進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，驗(yàn)證混合池是否為假陽(yáng)性并確定對(duì)應(yīng)的突變個(gè)體。在明確突變體后，再對(duì)目標(biāo)基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果可以再次驗(yàn)證是否真的為陽(yáng)性突變。

１．１群體準(zhǔn)備

產(chǎn)生適合ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的誘變?nèi)后w要求考慮以下因素：目標(biāo)群體的遺傳組成、誘變劑的種類(lèi)和處理方式、ＤＮＡ提取與建池策略等。

目標(biāo)群體的遺傳組成最好比較簡(jiǎn)單，首選純合自交系。并且為了減少親本個(gè)體間的遺傳差異，在保證能產(chǎn)生數(shù)千子代的前提下，應(yīng)當(dāng)選擇單個(gè)或盡可能少的供體親本。這方面，有些單倍體育種技術(shù)開(kāi)展得比較成功的作物（如甘藍(lán)型油菜等）無(wú)疑具有比較優(yōu)勢(shì)。而且只要有可能，供體親本就應(yīng)當(dāng)選擇大部分測(cè)序信息已經(jīng)知道的株系或品種。

誘變劑應(yīng)選擇點(diǎn)突變率高的誘變劑。ＥＭＳ由于突變密度高、使用簡(jiǎn)便可靠而倍受青睞。擬南芥種子ＥＭＳ突變體后代中，點(diǎn)突變隨機(jī)分布在染色體組上，其中編碼區(qū)５％突變?yōu)榫幋a產(chǎn)物的提前終止突變，５０％為改變編碼蛋白氨基酸系列的錯(cuò)義突變［８］。

誘變強(qiáng)度也是考慮因素之一，同樣處理的誘變方法在不同物種中的突變率相差很大。誘變會(huì)出現(xiàn)致死和不育現(xiàn)象，所以應(yīng)在突變率、致死率和不育率之間找到平衡。例如果蠅ＥＭＳ誘變劑量為５０ ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí)，平均每１５５．６ ｋｂ發(fā)生一個(gè)突變（１／１５５．６ ｋｂ，下同）；當(dāng)劑量提高到１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí)，突變頻率增加到１／９０．５ ｋｂ，但Ｆ２存活數(shù)從１ ９１５只（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）銳減至１７１只（１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）［３］。比較已有研究結(jié)果中的ＥＭＳ誘發(fā)突變的頻率，相差最高達(dá)４０倍。適宜濃度下最高突變率為六倍體小麥（１／２５ ｋｂ），接下來(lái)依次為四倍體小麥（１／４０ ｋｂ）［９］，果蠅（１／１５５．６ ｋｂ）［３］，擬南芥（１／１７０ ｋｂ）［８］，斑馬魚(yú)（１／２３０ ｋｂ）［１０，１１］，玉米（１／５００ ｋｂ）［１２，１３］，水稻（１／５００ ｋｂ）［１４］和大麥（１／１．４ Ｍｂ）［１５］，這些數(shù)據(jù)可能表明影響突變率的是生物體的倍性而不是基因組大小，多倍體生物可能耐受更高劑量的ＥＭＳ。但總體上，誘變處理后變異的分子機(jī)理方面的信息還不多，今后這方面的工作可能對(duì)改進(jìn)ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)很有幫助。

１．２ＤＮＡ取樣

ＤＮＡ取樣受到誘變劑處理方式的影響。植物中最常用的處理方式是將誘變劑配成溶液浸泡種子，這種方式雖然簡(jiǎn)便，但Ｍ１代突變體常為嵌合體，不能對(duì)Ｍ１直接取樣，因此，需要將Ｍ１自交得到Ｍ２。在有些大型作物（如玉米）中，為了減少Ｍ２的群體大小，常采用單子傳法，但這樣會(huì)損失２５％的突變體。另外一種較省時(shí)的方法是處理植物的花粉后給供體親本授粉，得到雜合的Ｍ１，這樣就可以對(duì)每一個(gè)Ｍ１單株取樣。Ｍ１自交得到的Ｍ２群體實(shí)際上是由多個(gè)家系構(gòu)成的，可以提供豐富的遺傳信息。利用花粉誘變，Ｔｉｌｌ等［１２，１３］成功獲得了由７５０個(gè)單株組成的群體，以１１個(gè)感興趣的基因?yàn)槟繕?biāo)，從中檢測(cè)出１７個(gè)突變體。這個(gè)實(shí)驗(yàn)可能對(duì)其他作物的誘變方式有指導(dǎo)意義。圖１表明了兩種處理方式的差異［１６］。

為了降低成本，ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)采取類(lèi)似分子標(biāo)記篩混合池的策略：將群體中的若干個(gè)單株ＤＮＡ樣混合作為模板擴(kuò)增。每個(gè)混合池中的樣本容量與檢測(cè)突變的靈敏度間有一個(gè)最合適的拐點(diǎn)，超過(guò)這個(gè)拐點(diǎn)，隨著混合池中樣本容量的增加，每個(gè)池中的雜合雙鏈的比率會(huì)減小，檢測(cè)的靈敏度也因此降低，因此每個(gè)物種應(yīng)當(dāng)根據(jù)倍性找到最適合自己的拐點(diǎn)。Joy等［１７］在對(duì)老鼠ＴＩＬＬＩＮＧ的研究中比較了１∶２、１∶５、１∶１０、１∶１５和１∶２０共５組混合池的檢測(cè)靈敏度，發(fā)現(xiàn)１∶１０混合池在靈敏度和成本間達(dá)到平衡，而擬南芥ＴＩＬＬＩＮＧ項(xiàng)目組采?。?jìng)€(gè)單株混合的方法，每板ＰＣＲ板因此能檢測(cè)７８４個(gè)（９８×８）單株，檢測(cè)效率也非常高［６］，混合池也可采用二維點(diǎn)陣法排列［１８］。

１．３引物設(shè)計(jì)與ＰＣＲ擴(kuò)增

按目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物，是ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的一個(gè)重要步驟，設(shè)計(jì)的好壞直接影響ＴＩＬＬＩＮＧ的篩選效果。Ｎｉｃｋ等專(zhuān)門(mén)為擬南芥ＴＩＬＬＩＮＧ項(xiàng)目研究開(kāi)發(fā)了ＣＯＤＤＬＥ程序。ＣＯＤＤＬＥ不僅能識(shí)別各種形式的序列信息，按輸入的堿基序列產(chǎn)生基因模型和蛋白質(zhì)保守區(qū)域模型，也能列出ＥＭＳ誘導(dǎo)植株產(chǎn)生有害突變的可能范圍。當(dāng)１ｋｂ左右的區(qū)段被選中后，研究人員可用Ｐｒｉｍｅｒ３程序設(shè)計(jì)引物［１９］。

ＴＩＬＬＩＮＧ的ＰＣＲ最適合的退火溫度由引物特性來(lái)確定，一般可使用Ｐｒｉｍｅｒ３程序給出的最適溫度。退火溫度一般較高，以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。如果目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率不高的話(huà)，則可以用巢式ＰＣＲ策略提高產(chǎn)率，如Ｓｙｌｋｅ等［３］用總共１０套引物通過(guò)３輪巢式ＰＣＲ成功擴(kuò)增出了３個(gè)不同基因（Ｓａｒａ，Ａｌｐ２３Ｂ和Ａｒｆ６）。

１．４點(diǎn)突變的檢測(cè)與鑒定

點(diǎn)突變的檢測(cè)一直是遺傳學(xué)的一道難題。要得到好的結(jié)果，不僅要求檢測(cè)儀器靈敏度高，還要能夠準(zhǔn)確識(shí)別假陽(yáng)性位點(diǎn)。對(duì)誘變后代目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序當(dāng)然是個(gè)可行的辦法，但當(dāng)誘變?nèi)后w比較大時(shí)，對(duì)每個(gè)后代個(gè)體進(jìn)行測(cè)序的成本太高，測(cè)序法當(dāng)然不現(xiàn)實(shí)。如果能先利用ＰＣＲ擴(kuò)增目標(biāo)基因，再快速區(qū)分ＰＣＲ產(chǎn)物，就可以將成本降至最低?，F(xiàn)代儀器分析技術(shù)與ＴＩＬＬＩＮＧ的結(jié)合很好地實(shí)現(xiàn)了這一設(shè)想。這些技術(shù)包括變性高效液相色譜（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）、毛細(xì)管電泳（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）和雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)，它們主要依賴(lài)色譜或電泳時(shí)的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)ＰＣＲ產(chǎn)物的分離。

將酶學(xué)技術(shù)引入ＴＩＬＬＩＮＧ又一次引起ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的飛躍。新技術(shù)體系是將ＰＣＲ產(chǎn)物先變性，然后復(fù)性，如此一來(lái)，只要混合池中有一條目標(biāo)基因的突變鏈，復(fù)性后的雙鏈中就會(huì)有一條來(lái)自突變型而另一條來(lái)自野生型，錯(cuò)配處形成環(huán)，此時(shí)利用一種特異的內(nèi)切酶酶切錯(cuò)配堿基［２０］，通過(guò)ＤＨＰＬＣ、ＣＥ或凝膠電泳就可以將野生型片段和被切斷的突變型片段分開(kāi)，并且錯(cuò)配堿基被切后的突變型片段長(zhǎng)度和被切片段之和應(yīng)當(dāng)?shù)扔谝吧推伍L(zhǎng)度，突變的位置也可據(jù)此判斷出來(lái)。

Ｃｅｌ Ⅰ是ＴＩＬＬＩＮＧ中常用到的一種錯(cuò)切酶，它是Ｓ１核酸酶家族中的一員。但與其他成員不同的是它更偏好高效切開(kāi)小的錯(cuò)配ＤＮＡ系列。該酶還具有ＤＮＡ５末端外切酶活性，所以在進(jìn)行ＴＩＬＬＩＮＧ時(shí)應(yīng)當(dāng)仔細(xì)控制Ｃｅｌ Ⅰ的反應(yīng)條件以避免它將底物降解［６］。Ｃｅｌ Ⅰ由一家公司商業(yè)化生產(chǎn)，價(jià)格較高，不少研究者找到了它的替代品。Ｗｕ等［２１］比較了ＭＢＮ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）和Ｃｅｌ Ⅰ的錯(cuò)切效率，結(jié)果表明所有Ｃｅｌ Ⅰ能切的錯(cuò)配均能被ＭＢＮ切割。而且Ｃｅｌ Ⅰ也可從白菜葉柄或芹菜汁中提?。郏玻玻?。

由于色譜柱只是單柱系統(tǒng)，ＤＨＰＬＣ檢測(cè)一次只能進(jìn)一個(gè)混合樣。毛細(xì)管電泳技術(shù)能一次分析９６個(gè)混合池的ＰＣＲ產(chǎn)物，但Ｒａｍａｎ等［２３］比較了毛細(xì)管電泳技術(shù)和測(cè)序技術(shù)分析突變體庫(kù)的效果，卻發(fā)現(xiàn)當(dāng)外顯子較小、ＳＮＰ頻率較高且外顯子間有多個(gè)內(nèi)含子的插入／缺失多態(tài)性時(shí)，ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)應(yīng)用起來(lái)比較麻煩。

而雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)則彌補(bǔ)了上述兩種檢測(cè)技術(shù)的缺陷。為了用熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)ＣｅｌⅠ酶切產(chǎn)物，事先要在ＰＣＲ反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記引物。雜質(zhì)、干擾分子在紅外光區(qū)幾乎不發(fā)光，所以用紅外熒光檢測(cè)的背景非常低，并且兩個(gè)通道波長(zhǎng)相距較遠(yuǎn)，幾乎無(wú)光譜重疊的干擾，從而保證了ＴＩＬＬＩＮＧ分析中每個(gè)突變堿基的準(zhǔn)確識(shí)別及整個(gè)檢測(cè)的靈敏度。Trenton等［２４］在反應(yīng)體系中加入用ＩＲＤ７００標(biāo)記的正向引物和ＩＲＤ８００標(biāo)記的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物在平板膠上電泳，然后分別用７００ ｎｍ和８００ ｎｍ兩個(gè)通道的波長(zhǎng)檢測(cè)，得到兩張電泳圖，再用ＵＮＩＸ程序“ｇｒａｂ”（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．Ｉｍａｇｅｍａｇｉｃｋ．ｏｒｇ）將ＬＩ－ＣＯＲ掃描儀上的圖像文件處理成適合于Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ分析的ＪＰＥＧ壓縮文件。

采用熒光標(biāo)記應(yīng)當(dāng)注意兩個(gè)問(wèn)題：①引物用熒光標(biāo)記之后，擴(kuò)增效率會(huì)下降；②ＩＲＤ８００標(biāo)記的引物活性比ＩＲＤ７００標(biāo)記的弱，所以８００ ｎｍ通道的信號(hào)比７００ ｎｍ的弱。Trenton等［２４］在反應(yīng)體系中按不同比例混入未標(biāo)記的引物，其中正向引物標(biāo)記的與未標(biāo)記的比例為３∶２，而反向引物比例為４∶１，從而解決了這兩個(gè)問(wèn)題。

２Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ：ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ是ＴＩＬＬＩＮＧ技術(shù)的變通，只是前者針對(duì)自然群體而后者針對(duì)誘變后代。自然群體中，Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ ４種堿基均可能發(fā)生突變，所以Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ檢測(cè)出的ＳＮＰ可能發(fā)生在目標(biāo)基因的任一堿基，有別于ＴＩＬＬＩＮＧ時(shí)的Ｇ堿基突變。

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ對(duì)難以誘變的生物（如某些樹(shù)木）和人類(lèi)反向遺傳學(xué)特別合適。它可以區(qū)分群體中目標(biāo)基因的基因型，也可以分析群體的遺傳多樣性。當(dāng)然，這種體系中，應(yīng)在混合池中加入對(duì)照的ＤＮＡ以產(chǎn)生目標(biāo)基因的雜合雙鏈。如Ｌｕｃａ等［２５］用Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ篩選了哥倫比亞生態(tài)型擬南芥１９２個(gè)株系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ完全可以有效發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因的ＳＮＰ，結(jié)合ＣｅｌⅠ酶切提供的位置信息，可以很容易區(qū)分出單模標(biāo)本（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）。Ｅｒｉｎ等［２６］收集三角葉楊４１個(gè)不同群體，以不列顛哥倫比亞大學(xué)植物園的一個(gè)群體為對(duì)照，確定９個(gè)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，調(diào)查該樹(shù)種的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因中ＳＮＰ從１個(gè)至２３個(gè)不等，總體上核苷酸多樣性相對(duì)較低（πｔｏｔａｌ＝０．００１ ８４），作者認(rèn)為對(duì)大范圍研究樹(shù)木自然變異而言，Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ比測(cè)序法更有效。人類(lèi)基因組測(cè)序完成后，人們發(fā)現(xiàn)個(gè)體基因組上核苷酸只有０．１％的差異。但如果要將這０．１％的差異歸為人與人不同的根本原因，顯然是高估了，因?yàn)橛行樱危胁⒉皇枪δ芑蛏系亩鄳B(tài)性。并且，有些ＳＮＰ在人群中并不具有普遍性（普遍性指大于５％），但那些稀有型（小于５％）ＳＮＰ也很可能是遺傳病的根本原因，用Ｓａｎｇｅｒ測(cè)序法分析這些稀有型ＳＮＰ或發(fā)現(xiàn)新的ＳＮＰ效率太低并且成本過(guò)高，而Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ可以很好解決這個(gè)問(wèn)題［１８］。

３ＴＩＬＬＩＮＧ有待解決的問(wèn)題

雖然ＴＩＬＬＩＮＧ是反向遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的一把利器，但在實(shí)際應(yīng)用中有些技術(shù)尚需改進(jìn)。

１）誘變強(qiáng)度（包括誘變劑濃度、處理時(shí)間）和處理方式是影響ＴＩＬＬＩＮＧ效果的很重要的因素。如前文所述，不同文章報(bào)道的誘變結(jié)果相差很大。雖然有多倍體可能更耐ＥＭＳ處理的推測(cè)，但針對(duì)不同物種何種誘變強(qiáng)度和處理方式最佳，實(shí)際工作中常常只能憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，今后可能還要在這方面做系統(tǒng)的研究［１６］。

２）突變體的保存也是個(gè)問(wèn)題。對(duì)多個(gè)功能基因的研究是相當(dāng)費(fèi)時(shí)的工作，在研究完成前，如何保存突變體？對(duì)植物而言，低溫保存可以解決這個(gè)問(wèn)題。而對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，就比較難了。Ｓｔｅｍｐｌｅ領(lǐng)導(dǎo)的研究小組收集了６ ０００條斑馬魚(yú)用于ＴＩＬＬＩＮＧ計(jì)劃，如此大的群體，飼養(yǎng)工作和飼養(yǎng)空間無(wú)疑增加了實(shí)驗(yàn)成本，而且由于壽命限制，還必須在魚(yú)死亡前完成突變體檢測(cè)和表型驗(yàn)證工作。期間部分個(gè)體的死亡不可避免，而這些個(gè)體可能就是突變基因的載體［２７，２８］。

３）功能基因的突變與對(duì)應(yīng)突變表型的分析仍然有大量工作要做。一旦點(diǎn)突變被發(fā)現(xiàn)后，對(duì)那些引起編碼蛋白功能損傷的突變就要進(jìn)行表型分析。但化學(xué)誘變引入了大量點(diǎn)突變，使得表型分析變得相對(duì)困難。例如ＭａＣａｌｌｕｍ等首次報(bào)道了用ＴＩＬＬＩＮＧ研究甲基化酶ＣＭＴ３等位基因，但一年多以后才完成詳細(xì)的表型分析。ＴＩＬＬＩＮＧ突變體越多，表型鑒定就越慢。而且，除了敲除突變，等位基因還可能有其他差異表達(dá)，所以下游工作變得更復(fù)雜。在基因組存在大量背景突變的前提下，如何避免把背景突變的表型誤檢為目標(biāo)基因的表型，這些問(wèn)題，就連ＴＩＬＬＩＮＧ領(lǐng)域的權(quán)威Ｓｔｅｖｅｎ等人［６］也感到“如同潮水般涌現(xiàn)的基因組測(cè)序結(jié)果一樣，突然出現(xiàn)的大量突變體材料令每個(gè)研究人員束手無(wú)策”。也許，解決這個(gè)問(wèn)題還得依靠多國(guó)科學(xué)家共同努力。

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（責(zé)任編輯王貴春）

收稿日期：２０１１－０９－１５

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（０９０４１１０２１）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（１１Ｂ０２０１）

作者簡(jiǎn)介：雷偉俠（１９７２－），女，陜西合陽(yáng)人，助理研究員，碩士，主要從事油菜分子生物技術(shù)及育種研究工作，（電話(huà)）１５８５６９４９６３５

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