王大浩等

摘要：洱源叢枝瑚（Ｒａｍａｒｉａ ｅｒｙｕａｎｅｎｓｉｓ）的石油醚萃取物經(jīng)2次柱層析分離得到對(duì)粘蟲有較高毒殺活性的組分Ｂ１０３。測(cè)定了Ｂ１０３對(duì)粘蟲３齡幼蟲的毒殺活性，在２．６ ｍｇ／ｍＬ劑量下，其２４ ｈ的毒殺效果達(dá)１００％。通過ＧＣ－ＭＳ分析表明其中含有３４個(gè)化合物，其中相對(duì)百分含量較高的化合物包括：反油酸甲酯（４０．０６％）、棕櫚酸甲酯（３１．０７％）和硬脂酸甲酯（８．２２％）等。

關(guān)鍵詞：洱源叢枝瑚（Ｒａｍａｒｉａ ｅｒｙｕａｎｅｎｓｉｓ）；殺蟲活性；ＧＣ－ＭＳ；脂肪酸甲酯

中圖分類號(hào)：Ｓ４８２．３９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0820-03

高等真菌中含有豐富的殺蟲活性物質(zhì)［１，２］。早期研究表明高等真菌對(duì)昆蟲表現(xiàn)出明顯的拒食及驅(qū)避作用［３］，某些高等真菌中的蛋白質(zhì)也具有明顯的殺蟲活性［４］。洱源叢枝瑚提取物中因含有豐富的殺蟲活性組分而受到人們的重視［５］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以粘蟲３齡幼蟲為供試對(duì)象，采用活性追蹤法分離純化其石油醚萃取物中殺蟲活性組分Ｂ１０３，通過ＧＣ－ＭＳ分析其化學(xué)組成。本研究的開展將有助于揭示洱源叢枝瑚中抗菌的活性化合物，為其開發(fā)提供借鑒和參考。

１材料與方法

１．１材料

洱源叢枝瑚（Ｒａｍａｒｉａ ｅｒｙｕａｎｅｎｓｉｓ）子實(shí)體，購(gòu)于云南，自然條件下陰干，粉碎后備用。

粘蟲（Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｓｅｐａｒａｔａ Ｗａｌｋｅｒ．），由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心養(yǎng)蟲室提供，試驗(yàn)時(shí)挑取生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)一致的健康３齡初期幼蟲供試。

１．２儀器

ＴＲＡＣＥ ＧＣ ２０００／ＤＳＱ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Ｔｈｅｒｍｏ），Ｗ５０１Ｂ型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司生產(chǎn)）；層析用石油醚（３０～６０ ℃）、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇等溶劑均為分析純，購(gòu)于西安化學(xué)試劑廠，層析用硅膠（２００～３００目）購(gòu)于青島海洋化工廠

１．３方法

１．３．１柱層析方法對(duì)洱源叢枝瑚石油醚萃取物浸膏用玻璃柱（８０ ｍｍ ＩＤ × １ ２００ ｍｍ）進(jìn)行硅膠（２００～３００目）柱層析分離，以氯仿∶乙酸乙酯（１０∶０，

９∶１，７∶３，６∶４，４∶６，０∶１０，體積比）和甲醇依次洗脫，收集（５００ ｍＬ／餾分），合并Ｒｆ值一致的餾分，得１５部分淋洗液，分別標(biāo)記為Ｂｎ（ｎ＝各部分淋洗液編號(hào)）。采用常壓柱層析對(duì)Ｂ１部分進(jìn)行柱層析分離，柱型５０ ｍｍ ＩＤ × ８０ ｍｍ，硅膠２００～３００目，上樣量為１５ ｇ，以石油醚∶氯仿（１０∶０，９∶１，４∶１，１∶１，０∶１０，體積比）、氯仿∶乙酸乙酯（９∶１，３∶１，０∶１０，體積比）依次洗脫，收集（２５０ ｍＬ／餾分），合并Ｒｆ值一致的餾分，濃縮，得１３部分淋洗液，標(biāo)記為Ｂ１０１，Ｂ１０２，Ｂ１０３，Ｂ１０４，Ｂ１０５，Ｂ１０６， Ｂ１０７， Ｂ１０８， Ｂ１０９， Ｂ１０１０， Ｂ１０１１， Ｂ１０１２，Ｂ１０１３。

１．３．２ＧＣ－ＭＳ測(cè)定氣相色譜條件為：ＤＢ５石英毛細(xì)管柱（３０ ｍ × ０．２５ ｍｍ × ０．２５ μｍ），接口溫度２５０℃，采用程序升溫模式，初始溫度為６０ ℃，恒溫 ４ ｍｉｎ 后以８℃／ｍｉｎ 升溫至２６０℃，恒溫 ２０ ｍｉｎ；載氣為９９． ９９９％高純氦氣，進(jìn)樣量為１ μＬ；質(zhì)譜條件：ＥＩ 離子源，電離電壓７０ ｅＶ，離子源溫度２５０ ℃，掃描范圍２０～５００ ｍ／ｚ，掃描速度１ ｓ／１０倍程。ＮＩＳＴ質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)計(jì)算機(jī)檢索確定各成分，采用面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

１．３．３生物活性測(cè)定對(duì)粘蟲的毒殺作用采用小葉碟添加法［６］：將新鮮飼喂葉片剪成１ ｃｍ × ２ ｃｍ大小的葉碟，于供試藥液中浸漬２～５ ｓ后自然晾干，同時(shí)用各溶劑作對(duì)照。在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中放入饑餓４ ｈ的試蟲，然后放入上述處理葉片。各試蟲每處理１０頭，重復(fù)３次，經(jīng)２４、４８、７２ ｈ后采用目測(cè)法檢查各處理試蟲死亡數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。死亡標(biāo)準(zhǔn)：蟲體失水皺縮，觸之不動(dòng)。觸殺活性測(cè)定采用點(diǎn)滴法［７］：將供試藥劑用丙酮稀釋至所需濃度，用微量毛細(xì)管（根據(jù)需要選擇０．０２４～０．９６０ μＬ不同型號(hào)）定量點(diǎn)滴施藥于試蟲幼蟲前胸背板，每處理點(diǎn)滴１０頭，設(shè)３次重復(fù)，對(duì)照點(diǎn)滴等量丙酮，點(diǎn)滴處理后試蟲置于養(yǎng)蟲室［Ｔ＝（２５±１）℃，ＲＨ＝７５％±５％，Ｄ／Ｌ＝１２ ｈ／１２ ｈ］飼養(yǎng)，２４ ｈ后采用目測(cè)法檢查各處理試蟲死亡數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。死亡標(biāo)準(zhǔn)同上。

２結(jié)果與分析

２．１生物活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)前期生物測(cè)定結(jié)果，以粘蟲３齡幼蟲為試蟲，采用小葉碟添加法對(duì)洱源叢枝瑚石油醚萃取物柱層析Ｂ１分離組分進(jìn)行生物活性測(cè)定，結(jié)果見表１。由表１可知，Ｂ１０３組分對(duì)粘蟲有較高的毒殺活性，２４ ｈ后校正死亡率達(dá)到１００％，其他部分對(duì)粘蟲均無(wú)明顯的毒殺活性。表明Ｂ１中對(duì)粘蟲有毒殺活性的成分主要集中在Ｂ１０３部分。

另外，為了進(jìn)一步明確Ｂ１０３組分對(duì)粘蟲毒殺活性的作用方式，采用點(diǎn)滴法測(cè)定其對(duì)粘蟲的觸殺活性，結(jié)果見表２。由表２可知，Ｂ１０３對(duì)粘蟲的２４ ｈ校正死亡率達(dá)４８．２８％，表明Ｂ１０３組分對(duì)粘蟲有一定的觸殺活性。

２．２ＧＣ－ＭＳ分析結(jié)果

對(duì)ＧＣ－ＭＳ譜圖進(jìn)行檢索分析，從Ｂ１０３組分中共鑒定化合物３４個(gè)，其中脂肪酸甲酯類化合物２３個(gè)，取代苯類化合物５個(gè)，烷烴類化合物４個(gè)，酮類化合物１個(gè)，醇類化合物１個(gè)，結(jié)果如表３所示。由表３可知，Ｂ１０３部分主要含有脂肪酸甲酯類，取代苯類，烷烴，酮和醇類化合物等，其相對(duì)含量分別為９４．６０％、１．２２％、０．７９％、０．１１％和０．１０％。由此推測(cè)Ｂ１０３對(duì)粘蟲有毒殺活性的物質(zhì)可能為脂肪酸甲酯類化合物。

３結(jié)論與討論

高等真菌中含有的脂肪酸類化合物具有殺線蟲作用［８］。國(guó)外對(duì)脂肪酸類化合物的殺蟲活性研究很多，但其防治對(duì)象主要是蚜蟲和蜘蛛綱害蟲，加上其他局限性而未能大范圍應(yīng)用［９］。國(guó)內(nèi)僅見馬承鑄等研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸類化合物能滲透和堵塞小菜蛾、豆圓蝽、稻薊馬等昆蟲呼吸道并覆蓋呼吸細(xì)胞表面，造成呼吸系統(tǒng)細(xì)胞膜破壞致使蟲體喪失正常生理功能，從而導(dǎo)致昆蟲死亡［１０］。

本研究分離得到對(duì)粘蟲具有毒殺作用的Ｂ１０３組分，主要成分為脂肪酸甲酯類化合物，其總的百分含量達(dá)到９４．６％，其中含量較高的分別為反油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、十七烷酸甲酯、亞油酸甲酯、十五烷酸甲酯、木蠟酸甲酯等。后期將主要對(duì)其作用致毒癥狀，致毒方式及致毒機(jī)理開展進(jìn)一步研究。另外，還將從反油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、十七烷酸甲酯、亞油酸甲酯、十五烷酸甲酯、木蠟酸甲酯等單一化合物的殺蟲活性進(jìn)行分析，從而確定Ｂ１０３組分中的殺蟲活性成分，為揭示這類化合物的作用機(jī)理和發(fā)現(xiàn)新的作用靶標(biāo)提供研究基礎(chǔ)。

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