賈勝潔等

摘要：分別建立叢枝菌根（ＡＭ）真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ與紫云英轉(zhuǎn)化根雙重共培養(yǎng)體系，并利用該體系研究不同Ｚｎ濃度對單接種與混合接種ＡＭ真菌侵染紫云英轉(zhuǎn)化根的影響。結(jié)果表明，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ提高了大部分處理的根段侵染率、菌絲密度以及Ｐ的吸收，０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ抑制了ＡＭ真菌菌絲的生長，但能增加部分處理轉(zhuǎn)化根對Ｐ的吸收。０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ濃度下，單接種Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、混合接種Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ與Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率最高，并且在混合侵染根段中Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ根段侵染率比Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ高１２％。

關(guān)鍵詞：叢枝菌根（ＡＭ）真菌；轉(zhuǎn)化根；共培養(yǎng)；Ｚｎ；Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ

中圖分類號：Ｑ９３９．５；Ｑ９３５文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0685-05

叢枝菌根（ＡＭ）真菌是一類與植物專性共生的真菌，能與８０％以上陸生維管植物形成互惠共生體，促進(jìn)植物吸收礦質(zhì)營養(yǎng)，增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫及病害的能力［１］。ＡＭ真菌營專性共生生活，至今尚未實現(xiàn)離體純培養(yǎng)。傳統(tǒng)的盆栽培養(yǎng)方法費(fèi)時費(fèi)力，無法避免外來細(xì)菌與真菌的污染，無法避免土壤緩沖和固結(jié)等干擾因素，只能進(jìn)行生理學(xué)與形態(tài)學(xué)觀察。相對意義的離體純培養(yǎng)經(jīng)歷了植物正常根系與ＡＭ真菌、植物轉(zhuǎn)化根系與ＡＭ真菌雙重共培養(yǎng)兩個階段。植物轉(zhuǎn)化根與ＡＭ真菌雙重共培養(yǎng)體系的優(yōu)點(diǎn)是能夠提供純凈、沒有污染的任何生長階段的ＡＭ真菌研究材料［２，３］，并且轉(zhuǎn)化根生長旺盛，縮短了ＡＭ真菌與宿主建立共培養(yǎng)體系的時間，比起傳統(tǒng)盆栽材料，更適合做形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的研究，為菌種鑒定和描述提供了可靠材料［４，５］。

Ｚｎ是植物體必需的微量元素，但是高濃度的Ｚｎ卻有毒害作用，可能引起氧化性損傷［６，７］。而ＡＭ真菌的某些蛋白質(zhì)參與抗氧化反應(yīng)的調(diào)節(jié)，能有效緩解Ｚｎ的氧化壓力和毒性［８］。此外，ＡＭ真菌通過增加自身生物量、根內(nèi)和根外菌絲量來增加對Ｚｎ的固定或者分泌金屬螯合物如蛋白質(zhì)球囊霉素來緩解Ｚｎ對植物的毒害［９］。

本研究擬在平板上建立ＡＭ真菌與轉(zhuǎn)化根共培養(yǎng)體系，研究不同Ｚｎ濃度對３種ＡＭ真菌單接種或雙接種侵染紫云英轉(zhuǎn)化根以及吸收Ｐ、吸收Ｚｎ的影響，為在分子水平上研究ＡＭ真菌的抗Ｚｎ機(jī)制提供有利的技術(shù)平臺。

１材料和方法

１．１材料

ＡＭ真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ，Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ來自法國，為盆栽培養(yǎng)所得接種劑；Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ為與胡蘿卜轉(zhuǎn)化根培養(yǎng)所得，由法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院（ＩＮＲＡ）Ｖｉｖｉｅｎｎｅ Ｇｉａｎｉｎａｚｚｉ－Ｐｅａｒｓｏｎ教授惠贈；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕａ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）、發(fā)根農(nóng)桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）Ｋ５９９由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室生物固氮室提供。

１．２方法

１．２．１特異性引物的設(shè)計分別抽提３種AM真菌孢子的ＤＮＡ，用真核生物通用引物ＬＲ１和ＮＤＬ２２擴(kuò)增核糖體25S ｒＤＮＡ序列，ＬＲ１的序列是：５′－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡ－３′，ＮＤＬ２２的序列是：５′－ＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧ－３′［１０］，得到的片段大小為７５０ ｂｐ，將ＤＮＡ條帶回收純化，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ＤＨ５α中，取陽性菌菌液測序，得到序列后進(jìn)行比對，設(shè)計特異性引物并進(jìn)行驗證。

１．２．２接種ＡＭ真菌和紫云英轉(zhuǎn)化根共培養(yǎng)參考并改進(jìn)Ｃｈｏ等［１１］的方法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化根：選取顆粒飽滿大小均勻的紫云英種子，用體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇溶液處理８ ｍｉｎ，無菌水沖洗５次，用體積分?jǐn)?shù)為３％的次氯酸鈉溶液表面消毒１０ ｍｉｎ，無菌水漂洗５次以盡可能除去種皮表面殘留的次氯酸鈉。將種子浸在無菌水中，置于２８ ℃培養(yǎng)箱中充分吸漲，平鋪于含５ ｇ／Ｌ蔗糖的瓊脂平板上，置于光照培養(yǎng)箱（１６ ｈ／ｄ，２２～２５ ℃）培養(yǎng)５～７ ｄ，取子葉展開的無菌幼苗，用解剖刀將下胚軸中部切斷，棄根，將紫云英幼苗傷口處浸沒于培養(yǎng)至對數(shù)期的發(fā)根農(nóng)桿菌Ｋ５９９菌液中，浸泡１５ ｍｉｎ，取出放于無菌濾紙上，吸干子葉表面所帶菌液，將幼苗置于含ＭＳ培養(yǎng)基［１２］的平板光照培養(yǎng)。３ ｄ后將帶有發(fā)根農(nóng)桿菌Ｋ５９９的幼苗轉(zhuǎn)入含有卡那霉素（４０ μｇ／ｍＬ）和羧芐青霉素（５０ μｇ／ｍＬ）的ＭＳ培養(yǎng)基中除菌并誘導(dǎo)發(fā)根。３周后紫云英幼苗愈傷組織處長出轉(zhuǎn)化根，剪下約５ ｃｍ根尖，轉(zhuǎn)接到與ＡＭ真菌雙重共培養(yǎng)所用ＭＳＲ培養(yǎng)基［１３］上，用含有抗生素與不含抗生素的ＭＳＲ培養(yǎng)基間隔除菌，直至將轉(zhuǎn)化根所帶發(fā)根農(nóng)桿菌Ｋ５９９除凈，經(jīng)ＧＵＳ染色驗證，最后獲得生長旺盛的無菌紫云英Ｒｉ Ｔ－ＤＮＡ轉(zhuǎn)化根。

用移液器分別吸打６個表面已經(jīng)滅菌的孢子鋪于ＭＳＲ培養(yǎng)基上。５ ｄ后，在孢子萌發(fā)良好、未見污染的皿內(nèi)添加５條生長旺盛的約５ ｃｍ長的紫云英轉(zhuǎn)化根，２６ ℃暗培養(yǎng)，每周取樣檢測各菌種侵染率。

１．２．３混合接種ＡＭ真菌和紫云英轉(zhuǎn)化根共培養(yǎng)設(shè)計兩種接種方式：Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ。各菌種按孢子個數(shù)比１∶１接種，總共６個表面消毒的孢子鋪于ＭＳＲ培養(yǎng)基上。其他操作同１．２．２。

１．２．４Ｚｎ對ＡＭ真菌侵染紫云英轉(zhuǎn)化根的影響配制Ｚｎ濃度為０（正常培養(yǎng)基中Ｚｎ含量）、０．１、０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭＳＲ培養(yǎng)基，按照前面提到的方法建立共培養(yǎng)，設(shè)置６種接種方式，３個單接種，２個雙接種，１個不接種，共１８種處理，每種處理８個重復(fù)，８周收獲，用Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色法和Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法檢查根段侵染率，顯微攝像法測量菌絲密度，原子吸收光譜分析法檢測根中Ｚｎ濃度，鉬銻抗比色法檢測根中Ｐ濃度等指標(biāo)。

２結(jié)果與分析

２．１特異性引物的驗證結(jié)果

將３種孢子的２５Ｓ ｒＤＮＡ測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對設(shè)計了Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ的特異性引物Ｇｉｇ．ｍ－Ｆ：５′－ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＧＴ ＣＣＴ ＴＡＡ ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＡＴ Ｇ－３′，Ｇｉｇ．ｍ－Ｒ：５′－ＧＡＴ ＡＣＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＴＧ－３′（５６６ ｂｐ）。Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ的特異性引物對為ＬＲ１/２３．２２（６３０ ｂｐ），其中，２３．２２：５′－ＧＡＡ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＣＡ ＴＧＣ ＴＡ－３′［１０］， Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的特異性引物對為ＬＲ１/８．２２（４５５ ｂｐ），其中，８．２２：５′－ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡ－３′［１０］。為了驗證３種引物對的特異性，取這３種孢子ＤＮＡ和紫云英根段ＤＮＡ進(jìn)行Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ擴(kuò)增。第一輪所用引物對為ＬＲ１／ＮＤＬ２２，第二輪ＰＣＲ分別使用特異性引物對Ｇｉｇ．ｍ－Ｆ／Ｇｉｇ．ｍ－Ｒ、ＬＲ１／２３．２２、ＬＲ１／８．２２，電泳結(jié)果顯示，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ的引物對Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英具有特異性，Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ的引物對Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英具有特異性，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的引物對Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ和紫云英均具有特異性（圖１）。

２．２紫云英轉(zhuǎn)化根的成功誘導(dǎo)和性狀

紫云英轉(zhuǎn)化根從愈傷組織處長出，無向地性，顏色較白，分枝多，生長旺盛，激素自養(yǎng)。由于轉(zhuǎn)入了發(fā)根農(nóng)桿菌K599的卡那霉素抗性基因和ｇｕｓ基因，可以在４０ μｇ／ｍＬ的卡那霉素下生長，并能夠被ＧＵＳ染成藍(lán)色，正常根仍然是白色（圖２）。

２．３共培養(yǎng)體系的建立以及成熟孢子的產(chǎn)生

各菌種在培養(yǎng)過程中孢子萌發(fā)管伸長，侵染紫云英轉(zhuǎn)化根，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ和Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ產(chǎn)生輔助細(xì)胞和叢枝，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ產(chǎn)生泡囊和叢枝等特殊結(jié)構(gòu)。Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ在第一周就有侵染，之后根段侵染率迅速增加，到第五周時達(dá)到４５％，之后趨于平穩(wěn)；Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ侵染較慢，兩周時才發(fā)現(xiàn)侵染，第五周時根段侵染率達(dá)到２２％，之后趨于穩(wěn)定，根段侵染率最低；Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在最初的四周根段侵染率較低，但是穩(wěn)定增長，到第六周時達(dá)到５１％，在３個菌種中根段侵染率最高（圖３）。各菌種均產(chǎn)生了成熟孢子，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ大約６周時產(chǎn)孢，新生孢子經(jīng)低溫處理后可以萌發(fā)并再次侵染紫云英轉(zhuǎn)化根；Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ大約８周時產(chǎn)孢，但新生孢子未見萌發(fā)；Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ大約５周時產(chǎn)孢，新生孢子無需低溫處理直接萌發(fā)并侵染紫云英轉(zhuǎn)化根，連續(xù)產(chǎn)生５代新生孢子（圖４）。混合接種處理中每個種均侵染轉(zhuǎn)化根，并產(chǎn)生成熟子代孢子。

２．４Ｚｎ對ＡＭ真菌侵染紫云英轉(zhuǎn)化根的影響

取各種處理的根段進(jìn)行Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色檢測侵染率（圖５），結(jié)果顯示在３種Ｚｎ濃度下，單接種的侵染率Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ＞Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ＞Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ提高了各種處理的根段侵染率，其中，單接種Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、混合接種Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ與Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率最高，Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ雙接種的根段侵染率介于兩個單接種根段侵染率之間；當(dāng)Ｚｎ濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ受Ｚｎ抑制較明顯，根段侵染率降低了４６％，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ雙接種處理的根段侵染率最高。為了進(jìn)一步探討雙接種中各菌種的侵染情況，采用Nested PCR法，用種特異性引物分別擴(kuò)增混合侵染根段，得到各菌種對混合侵染根段的侵染率（圖６），發(fā)現(xiàn)在Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ雙接種處理中，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在Ｚｎ濃度為０、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ時比Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ根段侵染率高，在混合侵染根段中占優(yōu)勢地位，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ濃度時，Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ根段侵染率比Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ高１２％，但是０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｚｎ對Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ抑制較明顯，兩者根段侵染率幾乎持平；在Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ 與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ雙接處理中Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率總是最高的。

從表１可見，隨著培養(yǎng)基中Ｚｎ濃度的增高，根內(nèi)的Ｚｎ濃度也隨之升高，在Ｚｎ濃度為０時，接種了ＡＭ真菌的處理比不接種的Ｚｎ濃度高，當(dāng)Ｚｎ濃度為０．１或０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時，接種ＡＭ真菌降低了根中Ｚｎ濃度；Ｚｎ濃度為０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ時，除了ＲＩ和ＮＭ，各處理的菌絲密度都有顯著增加，除了ＭＩ和ＲＩ，各處理的Ｐ的吸收也有增加；Ｚｎ濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時較大程度抑制了真菌菌絲的生長，菌絲密度下降，但是根內(nèi)Ｐ濃度略有上升。

３小結(jié)與討論

由發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)得到的Rｉ Ｔ－ＤＮＡ轉(zhuǎn)化根具有生長迅速、激素自養(yǎng)、生長條件簡單以及分化程度高、不易變異等特點(diǎn)。ＡＭ真菌和離體轉(zhuǎn)化根共培養(yǎng)體系的建立，豐富了ＡＭ真菌在分類學(xué)以及系統(tǒng)發(fā)育上的研究［５］。它能直觀地提供純凈的、沒有污染的任何生長階段的ＡＭ真菌研究材料［２，３］，比起傳統(tǒng)盆栽材料，它更適合做形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的研究，為菌種的鑒定和描述提供了可靠的材料［４］。

本試驗中，各菌種根段侵染率都比盆栽培養(yǎng)所得到的根段侵染率低，這可能由于雙重共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基含有高濃度無機(jī)鹽和碳水化合物，碳水化合物通過根表皮細(xì)胞直接滲透到根內(nèi)皮層細(xì)胞里，而不是像正常植物那樣通過光合作用獲得，影響了植物細(xì)胞和ＡＭ真菌共生的化學(xué)平衡［５］，因而ＡＭ真菌與植物的共生結(jié)構(gòu)數(shù)量減少，根段侵染率降低。

Ｚｎ濃度為０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ時大部分處理比不加Ｚｎ處理中的根外菌絲密度大，根中Ｐ含量也高，可能是ＡＭ真菌通過增加根外菌絲生物量來稀釋植物體或菌絲內(nèi)的Ｚｎ濃度，并且吸收更多的Ｐ來緩解Ｚｎ對根和本身的抑制作用，這與Ｓｍｉｔｈ等［１４］所得到的結(jié)果一致。Ｚｎ濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時ＡＭ真菌的生長受到抑制，根段侵染率顯著降低，這與Ｃａｖａｇｎａｒｏ等［１５］的盆栽試驗所得到的結(jié)論并不一致，可能是因為盆栽試驗所用土壤成分比較復(fù)雜，對Ｚｎ的緩沖能力較強(qiáng)，而培養(yǎng)基的緩沖能力比較差所致。

在所有的接種處理中，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ對轉(zhuǎn)化根的促生效應(yīng)比較明顯，與Ｇｉｇ． Ｍａｒｇａｒｉｔａ或Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ混合接種時表現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭優(yōu)勢，但是對高濃度Ｚｎ的抗性較差。Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的雙接種處理根段侵染率較高，Ｐ吸收較大，根外菌絲密度較大，比單接種Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ的效果好，與單接種Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的效果相似；Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ雙接種處理各項指標(biāo)都介于兩個單接種之間，并沒有產(chǎn)生混接優(yōu)勢。Ｊａｎｓａ等［１６］報道，Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇｌｏｍｕｓ ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ單接種、雙接種或三接種時，只有Ｇ． ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ與Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ雙接種的根段Ｐ濃度比單接種時高，產(chǎn)生功能互補(bǔ)，其他雙接種或三接種都沒有功能互補(bǔ)效應(yīng)。Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在雙重共培養(yǎng)體系中根段侵染率最高，接近盆栽試驗的根段侵染率，而且侵染快、產(chǎn)孢多，并且能夠連續(xù)產(chǎn)孢，是利用雙重共培養(yǎng)體系研究ＡＭ真菌與宿主植物相互作用的理想菌種。