国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

富鐵酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化

2012-04-28 10:12山東寶來利來生物工程股份有限公司徐海燕張志焱谷巍
中國飼料 2012年16期
關(guān)鍵詞:硫酸亞鐵酵母菌轉(zhuǎn)化率

山東寶來利來生物工程股份有限公司 徐海燕 張志焱 谷巍

目前,在國內(nèi)飼料中鐵元素主要以無機制劑形態(tài)添加,由于這些制劑在儲存或消化過程中會被酸化,從而使Fe2+變成難吸收的Fe3+(王利偉等,2002)。無機鐵與有機鐵相比具有不易吸收,對黏膜有刺激性,胃腸道副作用較大和不具有生物活性的特點(Gaudreau等,2001)。研究證實,酵母是一種較為理想的微量元素載體(李志東等,2006)。對于富鐵酵母而言,其主要是利用酵母細(xì)胞吸收多、轉(zhuǎn)化快的特性,使其作為微量元素的載體,在細(xì)胞內(nèi)將無機鐵轉(zhuǎn)化成有機形式,提高鐵的利用率,還可為動物機體提供大量的菌體蛋白、多肽、小肽、消化酶、氨基酸、豐富的B族維生素以及其他生物活性物質(zhì)(許禎瑩等,2010)。本試驗擬研究酵母菌富集微量元素鐵的影響因素,并確定富鐵酵母的最佳培養(yǎng)條件,為富鐵酵母的發(fā)酵生產(chǎn)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 5株產(chǎn)朊假絲酵母 (Candida utilis),編號為 CRJ1、CRJ2、CRJ3、CRJ4、CRJ5;2 株啤酒酵母,編號為PJ1、PJ2。均由山東寶來利來生物產(chǎn)業(yè)集團(tuán)生物研究院菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基:10°Bx的麥芽汁培養(yǎng)基,取1份麥芽粉加5份水,65℃水浴中保溫4 h,使其糖化,直至糖化完全 (檢查方法是取0.5 mL的糖化液,加2~3滴碘液,如無藍(lán)色出現(xiàn),即表示糖化完全);發(fā)酵培養(yǎng)基:采用YPD培養(yǎng)基,葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L,pH 6.0。

1.3 主要試劑 硫酸亞鐵、硫酸鐵銨、硝酸鐵、鄰二氮菲、鹽酸羥胺等均為分析純。

1.4 主要儀器 高壓滅菌鍋、超凈工作臺、酸度計、超聲波破碎儀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、UV-2000紫外可見分光光度計、電子天平、高速離心機、電熱板等。

1.5 方法

1.5.1 培養(yǎng)方法

1.5.1.1 液體種子將活化好的斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基 (50 mL/250 mL三角瓶)中,28℃培養(yǎng)16 h左右。

1.5.1.2 酵母細(xì)胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子以5%的接種量接種到含有Fe2+的發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min培養(yǎng)。其他培養(yǎng)條件由具體的試驗確定。

1.5.2 分析方法

1.5.2.1 菌體生物量的測定 取一定體積發(fā)酵液5000 r/min離心20 min,棄上清液,蒸餾水洗滌3次,最后收集菌體,60~70℃干燥后稱重即得。

1.5.2.2 酵母細(xì)胞鐵含量的測定 將富鐵酵母細(xì)胞發(fā)培養(yǎng)液5000 r/min離心20 min,棄上清液,沉淀用蒸餾水沖洗3次后,收獲菌體,干燥至恒重后,采用鄰二氮菲比色法測定鐵的含量(成都科學(xué)技術(shù)大學(xué)與浙江大學(xué)化學(xué)教研室,1993)。

1.5.2.3 富鐵酵母中有機鐵和無機鐵的測定 收集培養(yǎng)后的酵母菌液,5000 r/min離心20 min后棄上清液,然后用蒸餾水沖洗沉淀,再離心,重復(fù)3次,最后收集菌體4℃冷藏備用。準(zhǔn)確稱取一定量冷藏備用的菌體配制為25 mL懸浮液(加入相當(dāng)于6倍菌體重的含10%甘油,20 mmol/L Mg-Cl2·6H2O,pH 為 8.6 的 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液),破碎細(xì)胞后得到上清液(包括無機鐵和鐵蛋白)。在上清液中加入60%固體硫酸銨粉末,輕微振蕩5 min后靜置2 h,5000 r/min離心20 min以沉降含鐵蛋白。取上清液測定無機鐵含量。沉降的細(xì)胞殘片和含鐵蛋白65℃烘干后,混勻,取樣測定有機鐵含量。

1.5.3 試驗設(shè)計

1.5.3.1 菌種篩選 將7株試驗菌株接入種子培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。以5%的接種量接種到含硫酸亞鐵量為 600 μg/mL的YPD培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集菌體測定生物量和鐵含量。

1.5.3.2 不同鐵鹽對鐵富集的影響 選用幾種常用的鐵鹽作為鐵源,鐵離子濃度均為400 μg/mL。28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后,測定生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.3 鐵離子濃度對富鐵酵母的影響 將酵母依次接種到鐵含量為 0、200、400、600、800、1200、1600、2000 μg/mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩培養(yǎng)36 h,測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.4 起始pH對富鐵酵母的影響 將發(fā)酵培養(yǎng) 基 的 初 始 pH 分 別 調(diào) 為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,每 500 mL三角瓶裝液量 50 mL,接種量2%,28℃振蕩培養(yǎng)36 h,測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.5 接種量對富鐵酵母的影響 在500 mL三角瓶裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,將液體種子按2%、4%、6%、8%、10%的量接入到上述培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)36 h,測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.6 裝液量對富鐵酵母的影響 在500 mL三角瓶中分別裝入不同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基,其他條件相同,28℃振蕩培養(yǎng)36 h,測定其生物量、酵母細(xì)胞內(nèi)的鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.7 不同加鐵時間對富鐵酵母的影響 在其他條件相同的情況下,分別在發(fā)酵0、12、18、24 h向培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵至濃度為800 μg/mL來Fe2+,培養(yǎng)36 h結(jié)束,測定生物量、酵母細(xì)胞中鐵的含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率。

1.5.3.8 實驗室發(fā)酵罐培養(yǎng) 富鐵酵母菌株生長曲線的測定:在裝有5.0 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.0 L機械攪拌發(fā)酵罐中,根據(jù)實驗室三角瓶篩選出的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行恒定pH培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選 由表1可知,7株酵母菌對鐵的耐受能力均較強,產(chǎn)朊假絲酵母的生物量較高,均在1.20 g/100mL以上,啤酒酵母的稍低,但也均在1.00 g/100 mL以上。鐵的轉(zhuǎn)化率均在50%以上,酵母細(xì)胞中的鐵含量均比較高,在24000 μg/g以上,其中CRJ3的轉(zhuǎn)化率最高,達(dá)70.2%,酵母細(xì)胞中的鐵含量達(dá)到31200 μg/g,且總鐵含量也最高,達(dá)到421.2 mg/L。綜合考慮,以CRJ3作為試驗用菌株。

2.2 不同鐵鹽對鐵富集的影響 由表2可知,在相同的培養(yǎng)條件下,菌株CRJ3細(xì)胞與各種鐵化合物均能產(chǎn)生結(jié)合。試驗所用的5種鐵鹽對其生物量的影響較小,但對鐵的富集有較大的影響,其中硫酸亞鐵作為鐵源時,酵母細(xì)胞中的鐵及總鐵含量均最高,達(dá)到21124 μg/g和293.6 mg/L,轉(zhuǎn)化率為73.4%,因此,在后續(xù)的試驗中采用硫酸亞鐵作為鐵源。

表1 7株酵母菌富鐵能力比較

表2 不同鐵鹽對鐵富集的影響

2.3 鐵鹽濃度對富鐵酵母的影響 不同硫酸亞鐵濃度下菌株CRJ3的細(xì)胞生物量及鐵富集情況見表3。由表3可知,鐵鹽濃度在0~800 μg/mL范圍內(nèi)變化時,菌株CRJ3的生長趨于平緩,且總鐵含量在800 μg/mL時達(dá)到最高,為508.1 mg/L;當(dāng)起始濃度高于800 μg/mL時,隨著培養(yǎng)基中鐵濃度的升高菌株的生長受到明顯的抑制,但總鐵含量差異不顯著。綜合考慮,確定培養(yǎng)基中起始鐵濃度為 800 μg/mL。

表3 培養(yǎng)基中Fe2+添加量對富鐵酵母的影響

2.4 起始pH對富鐵酵母的影響 由表4可知,pH對酵母的生長影響較大,即弱酸性條件有利于酵母菌的生長,而中性偏堿的環(huán)境不利于酵母菌的生長;同時對鐵的富集也有較大的影響,pH可明顯影響酵母的生長和代謝,進(jìn)而影響生物量的累積及鐵的富集。在pH為6.5時,生物量達(dá)到最大,為1.36 g/100 mL,但酵母細(xì)胞中鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率在pH為5.0時達(dá)到最高,分別為39877 μg/g、510.4 mg/L 和 63.8%。 綜合考慮,富鐵酵母的最佳發(fā)酵起始pH確定為5.0。

表4 起始pH值對富鐵酵母的影響

2.5 接種量對富鐵酵母的影響 由表5可知,接種量對酵母鐵的生物量及鐵含量、轉(zhuǎn)化率均有較大的影響,接種量過大,可抑制生物量的累積及鐵的富集;接種量為6%時,生物量達(dá)到最大,為1.39 g/100 mL,接種量為2%時,酵母細(xì)胞中鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率均最高,分別為34364 μg/g、453.2 mg/L和56.7%。綜合考慮,確定接種量為2%。

表5 接種量對富鐵酵母的影響

2.6 裝液量對富鐵酵母的影響 本試驗利用不同的裝液量模擬溶解氧條件的影響,結(jié)果見表6。由表6可知,裝液量對菌株CRJ3的生物量及鐵的富集有較大的影響。裝液量在75 mL/500 mL三角瓶時,總鐵含量及轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最大,分別為410.4 mg/L和51.3%。

2.7 不同加鐵時間對富鐵酵母的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,為了確定最佳鐵鹽的加入時間,從而誘導(dǎo)細(xì)胞獲得較高的總鐵含量,試驗設(shè)計在不同發(fā)酵時間點加入硫酸亞鐵800 μg/mL。由表7可知,隨著加鐵時間的延遲,富鐵酵母的生物量呈遞增趨勢,但酵母細(xì)胞中的鐵、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率隨加鐵時間的延遲大幅降低。因此,在發(fā)酵開始即加入硫酸亞鐵,富鐵效果較好,可使細(xì)胞中鐵含量、總鐵含量及轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到34988 μg/g、454.8 mg/L 和 56.9%。

表6 裝液量對富鐵酵母的影響

表7 不同加鐵時間對富鐵酵母的影響

2.8 實驗室發(fā)酵罐培養(yǎng) 按2%的接種量接種,向初始培養(yǎng)基中加入800 μg/mL硫酸亞鐵,在(28~30)℃,初始轉(zhuǎn)速為 180 r/min,罐壓 0.05 MPa下進(jìn)行恒定pH培養(yǎng)(pH=5.0)。主要是根據(jù)培養(yǎng)基pH值的變化流加NaOH溶液,當(dāng)pH低于4.0時,加入堿液使pH升高至5.0。發(fā)酵過程中每2 h時取樣一次,測定發(fā)酵液的生物量以及總鐵含量。以酵母菌的生物量和總鐵含量為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),繪制富鐵酵母菌株CRJ3的生長曲線。由圖1可知,在優(yōu)化發(fā)酵條件下,該菌株在0~6 h處于延滯期,6 h以后進(jìn)入對數(shù)生長期,發(fā)酵24 h生物量達(dá)到最大,24~34 h生物量保持在一個相對穩(wěn)定的數(shù)值。隨著發(fā)酵時間的延長,總鐵含量呈上升趨勢,至24 h達(dá)到最高,之后總鐵含量有下降趨勢。從規(guī)模生產(chǎn)上考慮,發(fā)酵時間可以控制在24 h左右。

在上述優(yōu)化發(fā)酵條件下,對細(xì)胞所富集的鐵進(jìn)行了有機化程度分析,結(jié)果顯示,細(xì)胞所富集的鐵中約有98%為有機鐵。

圖1 菌株CRJ3的生長曲線及鐵富集曲線

3 結(jié)論

3.1 添加硫酸亞鐵對酵母菌的生長有一定的抑制作用,本試驗篩選出一株富鐵能力較高的產(chǎn)朊假絲酵母菌株CRJ3,作為試驗菌株。

3.2 本試驗綜合考慮產(chǎn)朊假絲酵母的生長周期,不同pH下生長的情況,以及耐受鐵的能力等,優(yōu)化得到富鐵酵母的最佳培養(yǎng)條件為:在500 mL三角瓶中裝入75 mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)基起始pH為5.0,所用的鐵源為硫酸亞鐵,濃度為800 μg/mL,并且在發(fā)酵開始即加入硫酸亞鐵,按2%的接種量,培養(yǎng)時間為24 h,在上述條件下進(jìn)行發(fā)酵,生物量能達(dá)1.30 g/100 mL,總鐵含量能450 mg/L以上,細(xì)胞中鐵的含量能達(dá)到35 mg/g以上。

3.3 按上述條件,采用實驗室發(fā)酵罐進(jìn)行恒定pH發(fā)酵,所得酵母菌體生物量能達(dá)到1.45g/100mL以上,總鐵含量能夠達(dá)500 mg/L左右,并且細(xì)胞所富集的鐵中約98%為有機鐵,適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

[1]成都科學(xué)技術(shù)大學(xué)與浙江大學(xué)分析化學(xué)教研室.分析化學(xué)試驗 (第二版)[M].北京:高等教育出版社,1993.155 ~ 161.

[2]李志東,李娜,張洪林,等.啤酒酵母吸附重金屬離子鉻的研究[J].中國釀造,2006,10:38 ~ 42.

[3]王利偉,錢愛東,林春艷,等.酵母富集微量元素鐵的研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2002,14:83 ~ 84.

[4]許禎瑩,陳代文,余冰.啤酒酵母富鐵培養(yǎng)條件篩選[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,28(1):52.

[5]Gaudreau H,Tompkins T A,Champagne C P.The distribution of iron in iron-enriched cells of Saccharomyces cerevisiae[J].Acta Alimentaria,2001,30:355~361.

[6]Shin Y M,Kwon T H,Kim K S,et al.Enhanced iron uptake of Saccharomyces cerevisiae by heterologous expression of a tadpole ferritin gene[J].Appl Environ Microbiol,2001,67:1280 ~ 1283.

猜你喜歡
硫酸亞鐵酵母菌轉(zhuǎn)化率
我國全產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域平均國際標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化率已達(dá)75%
米卡芬凈對光滑假絲酵母菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)活性的影響
硫酸亞鐵溶液與氧氣及次氯酸鈉反應(yīng)的實驗探究
為什么酵母菌既能做面包也能釀酒?
酵母菌及其衍生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究與應(yīng)用
郫縣豆瓣中一株耐鹽酵母菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能
碳酸鈉及碳酸氫鈉與硫酸亞鐵反應(yīng)的探究
曲料配比與米渣生醬油蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性
硫酸亞鐵修復(fù)鉻污染土壤的研究進(jìn)展
透視化學(xué)平衡中的轉(zhuǎn)化率
乃东县| 临汾市| 莱阳市| 平原县| 东宁县| 邯郸市| 武威市| 高要市| 大洼县| 淅川县| 延安市| 高雄县| 包头市| 佳木斯市| 淮阳县| 兴仁县| 甘孜县| 临桂县| 乐陵市| 绿春县| 咸阳市| 象州县| 宁陵县| 湖州市| 和龙市| 南通市| 大化| 陆良县| 蚌埠市| 大同市| 嵩明县| 新昌县| 礼泉县| 灵璧县| 营山县| 巴里| 孝义市| 荣昌县| 清水县| 丰都县| 兴仁县|