武漢工業(yè)學院動物科學與營養(yǎng)工程學院

動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室 竇茂鑫 趙迪 丁斌鷹 侯永清 吳濤＊

微生態(tài)飼用添加劑具有良好的生物學活性，能調節(jié)動物胃腸道微生物菌群的平衡，促進動物消化吸收、生長發(fā)育，提高飼料轉化率和生產性能，增強動物免疫力，以及具有改善飼養(yǎng)環(huán)境和減少環(huán)境污染的獨特作用（Gomze等，2007；王旭明等，2002）。芽孢乳酸菌因其同時具有乳酸菌和芽孢桿菌的優(yōu)點而成為為理想的益生菌之一 （相菲和徐厚春，2009）。本試驗對飼用芽孢乳酸菌的生物學特性進行研究，以期為微生態(tài)飼料添加劑的研發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 試驗益生菌：芽孢乳酸菌，由武漢泛華生物技術有限公司提供；試驗致病菌：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，由華中農業(yè)大學國家農業(yè)微生物重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸出物3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，葡萄糖 15 g，瓊脂 15 g，調整pH 7.2，定容至1000 mL。普通液體培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.1.3 主要試劑 PBS緩沖液，用于菌液的稀釋。

1.1.4 主要器材 電子天平 （沈陽龍騰電子有限公司），酸度計 （成都方舟科技開發(fā)公司），UV-1200 spectrophoto meter（美譜達儀器公司），立式超低溫保溫箱（海爾公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢乳酸菌的復蘇 將-20℃保存的菌株按1%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h，待渾濁后進行后續(xù)試驗。

1.2.2 生長曲線測定 將復蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165 r/min條件下培養(yǎng)，以普通液體培養(yǎng)基作校正，測定不同時間段培養(yǎng)液的OD600值，前24 h每1 h一測，后36 h每2 h一測。

1.2.3 產酸能力測定 將復蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165r/min條件下培養(yǎng)，測定不同時間段培養(yǎng)液的pH（郭志杰等，2010）。

1.2.4 高溫耐受性試驗 將復蘇后菌液按1%的接種量接種于PBS緩沖液中，分別置于60、70、80、90℃的水浴鍋中處理10 min，分別于處理前和處理后進行平板涂布，計算存活率 （范俊娟，2009）。

1.2.5 耐酸性試驗 用鹽酸調節(jié)PBS緩沖液的pH 分別為 2.0、2.5、3.0、4.0，121 ℃高壓滅菌后備用。將復蘇菌液按1%的接種量接種于上述pH梯度稀釋液中，37℃作用3 h，渦旋混勻，涂布平板進行活菌計數(shù)，以0 h計數(shù)為對照，計算存活率（劉文華等，2008）。

1.2.6 耐膽鹽試驗 用PBS緩沖液配制濃度分別為0.2%、0.5%、0.8%、1.0%的豬膽鹽溶液，高壓滅菌后備用。按1%的接種量將復蘇菌液接種于上述不同濃度的豬膽鹽溶液中，37℃作用3 h后，涂布平板進行活菌計數(shù)，以處理前細菌數(shù)為對照，計算存活率（趙瑞香等，2004）。

1.2.7 抑菌性試驗 將致病菌分別培養(yǎng)12～24h，按20倍稀釋，取100 μL致病菌液均勻涂布到事先準備好的無菌瓊脂平板上。采用牛津杯法，每個試驗設3個重復，37℃培養(yǎng)12～24 h，測定抑菌圈直徑，以無菌普通液體培養(yǎng)基作對照 （郭志杰等，2010）。

2 結果

2.1 芽孢乳酸菌的生長曲線測定結果 由圖1可知，芽孢乳酸菌未經過遲緩期，直接進入對數(shù)期生長，0～6 h生長速度最快，6～18 h生長速率減緩，18～26 h生長速率有所提高，26～34 h生物量變化不明顯，達到穩(wěn)定期，34 h生物量開始降低，進入衰亡期。

2.2 芽孢乳酸菌的產酸能力測定結果 由圖2可知，0～10 h芽孢乳酸菌產酸能力非常強，培養(yǎng)液的pH迅速降低，10～12 h培養(yǎng)液pH有短暫的回升，然后又繼續(xù)降低，32 h pH為3.60，此時pH降到最低。之后pH逐漸升高，最后pH在3.80左右趨于穩(wěn)定。

圖1 芽孢乳酸菌生長曲線測定結果

圖2 芽孢乳酸菌產酸能力測定結果

2.3 芽孢乳酸菌的高溫耐受性試驗結果 由圖3可知，對芽孢乳酸菌進行高溫處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在60℃處理10 min后存活率達94.37%，90℃處理10 min后存活率高達70%以上，說明芽孢乳酸菌對高溫有較好的耐受性。

圖3 芽孢乳酸菌高溫耐受性試驗結果

2.4 芽孢乳酸菌的耐酸性試驗結果 益生菌要到達腸道發(fā)揮作用，必須經過胃酸的作用，因此其必須具有良好的耐酸能力，才能到達腸道發(fā)揮功能。由圖4可知，對該芽孢乳酸菌進行酸處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在pH 2.0環(huán)境中存活率高達54.69%，說明芽孢乳酸菌具有較好的耐酸特性。

2.5 芽孢乳酸菌的耐膽鹽試驗 結果 益生菌到達十二指腸時要受到膽鹽的抑制作用，因此必須有較高的膽鹽耐受性，才能發(fā)揮益生特性。由圖5可知，對該芽孢乳酸菌進行膽鹽處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在0.2%豬膽鹽溶液中存活率在90%以上，在1.0%的豬膽鹽溶液中存活率超過20%，說明芽孢乳酸菌具有較強的耐膽鹽特性。

圖4 芽孢乳酸菌耐酸性試驗結果

圖5 芽孢乳酸菌耐膽鹽試驗結果

2.6 芽孢乳酸菌的抑菌性試驗結果 由表1可知，芽孢乳酸菌對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，其中對沙門氏菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為19.76 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌性最弱，但抑菌圈直徑也較大?？傮w看來，芽孢乳酸菌對腸道常見致病菌具有較強的抑制作用。

表1 芽孢乳酸菌抑菌試驗結果

3 結論

益生菌通過添加到飼料進入胃腸道,在胃腸道中定殖,并能通過大量繁殖的有益菌發(fā)揮其益生作用。研究表明,理想的益生菌應具有生長速度快、對胃腸道環(huán)境(胃酸、膽鹽等)耐受能力強,具有一定的抑菌能力等特點 （Geimonde和Salminen，2006）。 Hyronymus等（2000）研究報道,芽孢乳酸桿菌、左旋乳酸芽孢桿菌、消旋乳酸芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌在pH 2.0中生長受到強烈的抑制。Guo等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，中低質量分數(shù)膽鹽(≤0.3%)對芽孢桿菌的存活影響很?。欢哔|量分數(shù)的膽鹽（>0.3%）對不同來源菌株的耐受能力就表現(xiàn)出明顯的差異（王煥等，2008）。芽孢桿菌的抑菌作用，不同菌株各有不同。王德培等（2010）對分離到的1株枯草芽孢桿菌的抑菌譜進行了研究，結果表明，該枯草芽孢桿菌具有廣譜抗真菌活性。陳家祥等（2010）研究報道，加地衣芽孢桿菌有益于肉雞的腸道發(fā)育，能夠抑制盲腸內有害菌的生長。

本試驗表明，此株芽孢乳酸菌具有較好的生長性能和產酸能力，在24 h之后會逐步進入穩(wěn)定期，最終pH值會達到3.80左右，這有利于在消化道內定植后快速生長及維持消化道的酸性環(huán)境。此外，芽孢乳酸菌具有優(yōu)良的生物學特性，可耐受90℃高溫，有利于微生態(tài)添加劑的生產；能耐受pH 2.0的酸性環(huán)境，存活率達到50%以上，使芽孢乳酸菌能順利通過胃內酸性環(huán)境到達腸道發(fā)揮生物學功能；對豬膽鹽溶液也有較高的耐受性，在發(fā)揮功能的同時免受豬膽汁酸的抑制作用。從整體水平可以看出，此株芽孢乳酸菌具有較好的生物學功能，可以作為微生態(tài)飼料添加劑生產使用。

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