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長期高糖導致SH-SY5Y細胞內(nèi)多巴胺儲量減少

2012-04-27 03:39:10謝冰潔
生命科學儀器 2012年4期
關鍵詞:正常人帕金森病多巴胺

彭 磊,謝冰潔*

(北京理工大學,北京,100081)

前言

糖尿病(diabetes)是一種與胰島素產(chǎn)生和作用異常相關、以高血糖癥為主要特征的代謝性疾病。糖尿病對神經(jīng)系統(tǒng)的影響是全身性的,可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)[1][2]。帕金森病是一種與年齡有關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,病因迄今不明。其主要的病理變化是黑質(zhì)致密部(DSN)的多巴胺(DA)能神經(jīng)元選擇性缺失及紋狀體多巴胺含量明顯減少,殘留神經(jīng)元胞漿中出現(xiàn)嗜酸性包涵體—Lewy小體[3]。導致帕金森病主要有遺傳因素和環(huán)境因素,遺傳因素不能完全解釋其臨床特征,而且臨床上有80%以上的患者為散發(fā)性,病因不明。流行病學調(diào)查顯示:喝井水、農(nóng)村生活史和殺蟲藥、除草劑等工業(yè)化合物的暴露是誘發(fā)PD的潛在危險因素。據(jù)文獻報道,臨床上在50、60年代糖尿病患者患帕金森病的患病率為73%,70年代為50%,90年代時為30.5%,而正常人患帕金森病的患病率僅為1%。行病學調(diào)查顯示:糖尿病患者比正常人得帕金森病的幾率要高83%以上[4]。尤其早期糖尿病,在沒有其他并發(fā)癥的時候,其患帕金森的的幾率是正常人的7倍[5]。糖尿病(diabetes)和帕金森癥是兩種世界性的,常見高發(fā)的慢性病,對人類的生命健康威脅極大。流行病學研究提示我們糖尿病這種代謝系統(tǒng)疾病可能作為散發(fā)性PD患者的一個重要原因。多巴胺是腦內(nèi)正常的神經(jīng)遞質(zhì)。多巴胺在由酪氨酸羥化酶合成后儲存于突觸囊泡,胞吐作用釋放至突觸間隙,部分通過DAT重攝取入胞質(zhì)由VMAT2轉(zhuǎn)運至囊泡,避免DA在胞質(zhì)內(nèi)的過氧化,維持DA的穩(wěn)態(tài)和循環(huán)利用[6][7]。而在帕金森病的晚期,有一個特征就是黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺含量減少。所以本研究以SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤作為多巴胺能神經(jīng)元的細胞模型,研究長期高葡萄糖的情況下,細胞內(nèi)多巴胺的含量.

2 材料與方法

2.1 實驗試劑與儀器

細胞培養(yǎng)基: Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM),美國 Gibco 公司;胎牛血清:美國 Gibco 公司;青霉素、硫酸鏈霉素、胰蛋白酶:北京拜爾迪公司;5-氟苯基色譜分離柱HS F5 column(5μm, 250 mm×4.6 mm):美國Discovery?公司;庫倫陣列高效液相色譜-電化學檢測系統(tǒng) CoulArray?Multi-Channel ECD system:美國 Esa公司;多巴胺標準品:美國 Sigma公司.

2.2 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y(人成神經(jīng)細胞瘤細胞)由本實驗室保藏。使用含 DMEM高糖培養(yǎng)基 90 %,胎牛血清10 %的培養(yǎng)液,于 37℃二氧化碳濃度 5 %濕度90%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 多巴胺及其代謝產(chǎn)物的檢測

離心收集培養(yǎng)的細胞,按照3個大皿200μ 的比例將細胞重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS 溶液中。使用細胞超聲破碎儀以 2s on,1s off的條件破碎 40秒,取10μL破碎液進行蛋白濃度測定,其余破碎液以 10:1的比例加入 0.1M 高氯酸除蛋白,樣品于 4℃下以17,000 g離心20分鐘,取上層清液,經(jīng)0.22μm 水系濾膜過濾后作為色譜檢測樣品。利用HPLC-ECD 檢測色譜條件:流動相 45mM 磷酸氫二鈉、35mM 檸檬酸、0.13mM Na2EDTA、8% 乙腈 , pH 值 4.0 ,流速 1mL/min 進樣量 40μL 檢測器電勢 -50、50、300、350mV

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本研究中所有實驗數(shù)據(jù)利用 Microsoft Office Excel 2007 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。平行處理的樣本進行平均值及標準誤計算后做圖,并以誤差線的形式表示標準誤。使用 SSPS 13.0軟件進行t 檢驗(平均值的成對二樣本分析)以分析顯著性,*代表 P﹤0.05,**代表P﹤0.01。所有給出顯著性分析的實驗中,重復樣本數(shù) n均≥3。

3 實驗結(jié)果

3.1 多巴胺含量的檢測

本實驗以SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤作為多巴胺能神經(jīng)元的細胞模型,以200mmol/L葡萄糖處理SH-SY5Y模型細胞48小時,收集細胞,破碎細胞,用HPLC-ECD檢測細胞內(nèi)多巴胺的含量,結(jié)果如圖一:

圖1 細胞內(nèi)多巴胺含量的檢測綠線是對照組,藍線是高糖處理組。紅線為多巴胺標準品

圖2 細胞內(nèi)多巴胺含量統(tǒng)計圖

從圖2中可以看出:高糖處理下,SH-SY5Y細胞中多巴胺儲量下降。多巴胺是腦內(nèi)正常的神經(jīng)遞質(zhì),由酪氨酸羥化酶合成后儲存于突觸囊泡,胞吐作用釋放至突觸間隙,部分通過DAT重攝取入胞質(zhì)維持DA的穩(wěn)態(tài)和循環(huán)利用[6][7]。而在帕金森病的晚期,有一個特征就是黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺含量減少。長期高葡萄糖的情況下,細胞內(nèi)多巴胺的含量減少,提示我們糖尿病患者有可能通過減少多巴胺能神經(jīng)元中多巴胺含量增加患帕金森病的風險.

4 討論

在帕金森病的病因調(diào)查當中,環(huán)境因素成為散發(fā)性PD的主要原因, 人在外界環(huán)境作用下,如:化學藥物、環(huán)境污染、物理損傷、情緒壓力等,會產(chǎn)生系列的應激反應,如:氧化應激。氧化應激能夠?qū)е翷PO并產(chǎn)生一系列的小分子活性醛(如甲醛、乙醛、丙二醛、丙酮醛等),糖化反應(Glycation)或氨基酸氧化(amino acide oxidation)都是小分子活性醛可能的來源[8][9]?;钚匀┡cDA作用能夠在腦內(nèi)生成CAIQs,合成過程可能包括合成酶催化和Pictet-Splender縮合反應兩種途徑[10][11]。它可以聚集在線粒體上抑制ComplexⅠ的活性,造成線粒體功能障礙,ATP合成降低和能量危機。最終導致多巴胺能神經(jīng)元細胞死亡。

正常人患帕金森病的患病率僅為1%。行病學調(diào)查顯示:糖尿病患者比正常人得帕金森病的幾率要高83%以上[4]。尤其早期糖尿病,在沒有其他并發(fā)癥的時候,其患帕金森的幾率是正常人的7倍[5]。我國糖尿病人群的構(gòu)成以2 型糖尿病為主,占糖尿病人群的90% 以上。2 型糖尿病的病因非常復雜,涉及到各種遺傳因素和環(huán)境因素以及它們間的相互作用。

研究發(fā)現(xiàn) :與正常個體相比 ,患者體內(nèi)丙酮醛濃度明顯增高.在藥物進行治療后,雖然血糖有所降低,但那是丙酮醛的含量無法回到基線[12]。

本研究證明高糖長期處理下SH-SY5Y細胞中多巴胺儲量下降。糖尿病患者腦內(nèi)丙酮醛濃度明顯增高。黑質(zhì)致密部和紋狀體區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元區(qū),由于神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的含量很高,丙酮醛是多功能團羰基化合(DMCs)交聯(lián)儲存多巴胺的囊泡,使囊泡中的多巴胺游離出來,其又極易與含有氨基的多巴胺發(fā)生反應, 破環(huán)了多巴胺的穩(wěn)態(tài),使細胞內(nèi)多巴胺的儲量減少。

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