王 碩，睢大，陳志鴻，惠 敏，陳麗玲，王 琦，曲紹春，于曉風(fēng)，富 力

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021；3.福建歸真堂藥業(yè)股份有限公司，福建 福州 350000；4.大連富生天然藥物開發(fā)有限公司，遼寧 大連 116000)

熊膽為熊科(Ursidae)動(dòng)物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier或棕熊Ursus arctos Linnaeus的干燥膽[1]，熊膽粉為經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品。熊膽具有解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)靜、抗驚闕、解痙、保肝、利膽、抑菌及對(duì)心血管病、抗病毒、抗炎、抗菌、預(yù)防膽結(jié)石及溶解膽石等作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),熊膽粉對(duì)腫瘤細(xì)胞的增長有一定抑制作用，但尚未見抗肝癌的報(bào)道。為了系統(tǒng)開發(fā)利用熊膽這一中藥資源，本文采用小鼠體內(nèi)移植性腫瘤肝癌H22模型，對(duì)熊膽粉抗肝癌藥效及量效關(guān)系進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 藥物 熊膽粉(白色粉末)，福建歸真堂藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)20100521，使用時(shí)以蒸餾水配成不同濃度；環(huán)磷酰胺(規(guī)格:200 mg/支)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，批號(hào)20100318，使用時(shí)以蒸餾水配成0.1%溶液。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雄性，合格證號(hào)SCXK-(吉)2007-0003，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.3 細(xì)胞株 小鼠肝癌H22由吉林省腫瘤研究所提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

2 方法

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，即：對(duì)照組(給予蒸餾水)；陽性藥物組(給予環(huán)磷酰胺20 mg/kg)及熊膽粉5個(gè)劑量組(分別給予熊膽粉100、200、400、800、1 600 mg/kg)。按抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)方法制備體內(nèi)移植性腫瘤模型[3-4]，取接種于昆明種小鼠第7天的肝癌H22腹水，在無菌條件下配制成瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為1×107/mL，接種于昆明種小鼠左腹股溝皮下，每只小鼠接種0.2 mL。接種次日起給藥，各組均每日灌胃給藥1次，給藥容量為 0.2 mL/10 g，共12 d。于停藥后24 h稱取動(dòng)物的體質(zhì)量，頸椎脫臼處死荷瘤小鼠，剝離腫瘤組織，稱重。摘取胸腺、脾臟、肝臟稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及肝指數(shù)。結(jié)果以腫瘤生長抑瘤率表示：

抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照平均瘤組)×100%

取符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求(對(duì)照組平均瘤重>1 g，且瘤重<400 mg的動(dòng)物數(shù)不超過總數(shù)的20%)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 熊膽粉對(duì)小鼠肝癌H22的抑制作用 見表1。

表1結(jié)果顯示，陽性藥環(huán)磷酰胺20 mg/kg對(duì)肝癌H22的抑瘤率為86.68%，熊膽粉100、200、400、800、1 600 mg/kg 5個(gè)劑量組對(duì)肝癌H22的抑瘤率為36.00%、52.81%、61.44%、51.39%及45.96%，提示熊膽粉在200～800 mg/kg劑量范圍內(nèi)，對(duì)肝癌H22的抑瘤率較高，可達(dá)50%～60%。

表1 熊膽粉對(duì)小鼠肝癌H22的生長抑制作用(±s)

3.2 熊膽粉對(duì)肝癌H22小鼠臟器指數(shù)的影響 見表2。

表2 熊膽粉對(duì)肝癌H22小鼠臟器指數(shù)的影響(±s)

表2結(jié)果顯示，陽性藥環(huán)磷酰胺可使肝癌H22小鼠的體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及肝指數(shù)均明顯降低，而熊膽粉5個(gè)劑量組對(duì)肝癌H22小鼠的體質(zhì)量、胸腺批數(shù)、脾指數(shù)及肝指數(shù)均無明顯影響。

4 討論

熊膽的化學(xué)成分比較復(fù)雜，包括膽汁酸類、膽固醇類、膽色素類、氨基酸類，還有微量元素。膽汁酸類中含有膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、去氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、牛磺鵝去氧膽酸等，其中熊去氧膽酸即3α、7β-二羥基-5β-膽烷酸是中藥熊膽的主要成分[5]。 中醫(yī)藥古籍和傳統(tǒng)方劑中涉及熊膽方劑有366個(gè)之多,主要功效包括清熱解毒、明目退翳、生肌美顏、消腫止痛等[5]。近年來研究[6]表明，熊膽粉的化學(xué)成分主要為膽汁酸類，其中熊去氧膽酸是熊膽粉的主要成分。李麗敏等[7]通過HPLC-ELSD法測(cè)定了熊膽粉提取物中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。鄭興等[8]以吡啶-苯甲酰氯為柱前衍生化試劑，以RP-HPLC測(cè)定了熊膽粉中牛黃去氧膽酸的含量。王春青等[9]研究發(fā)現(xiàn)熊膽粉可有效清除亞硝胺前體物-亞硝酸鈉，并能阻斷二甲基亞硝胺在體外合成，其清除率與阻斷率呈量效關(guān)系，表明熊膽粉具有預(yù)防某些癌癥作用。孫鐵民等[10]用熊膽對(duì)K562、SP20腫瘤細(xì)胞株和小鼠S180腹水癌抑瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)熊膽粉有抑制腫瘤細(xì)胞生長、延長生存期、提高免疫功能的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熊膽粉100～1 600 mg/kg劑量對(duì)肝癌H22的抑瘤率在36.00%～61.44%之間，均表現(xiàn)出良好的抗肝癌H22活性，以200～800 mg/kg劑量范圍對(duì)肝癌H22的抑瘤率最高，可達(dá)50%～60%。因此，確定其抗肝癌H22的3個(gè)最佳劑量為200、400、800 mg/kg，為進(jìn)一步開發(fā)中藥熊膽提供了初步的科學(xué)依據(jù)。

[1]鄧明魯.中國動(dòng)物藥資源[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:308.

[2]連常寶.熊膽粉的藥理作用及臨床應(yīng)用研究概述[J].海峽藥學(xué),2008,20(8):72-74.

[3]李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991:513.

[4]韓銳.抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1997:297-298.

[5]王露霏,曲曉波,胡麗娜,等.動(dòng)物藥整理研究:熊膽[J].吉林中醫(yī)藥,2009,29(3):238-240.

[6]楊繼凡,王亦兵.熊脫氧膽酸的藥理作用和臨床作用[J].新藥與臨床,1985,4(3):23.

[7]李麗敏,錢大公,王柯,等.熊膽粉提取物中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的HPLC-ELSD測(cè)定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2009,40(1):39-40.

[8]鄭興,金東日.柱前衍生RP-HPLC測(cè)定熊膽粉中?；切苋パ跄懰岬暮縖J].遼寧中醫(yī)雜志,2010,37(12):2428-2429.

[9]王春青,呂樹臣.熊膽的藥理作用與開發(fā)利用[J].當(dāng)代畜牧,2003,11(2):35-36.

[10]孫鐵民,梁偉,張啟明,等.熊膽抑瘤作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2003,30(1):63.