張 鐸（綜述） 陶 磊（審校） 路麗明

（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031）

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是從葫蘆科植物栝蔞的塊根中提取出來的相對分子質(zhì)量（Mr）為27 000的單鏈核糖體活性抑制蛋白（ribosome inactivating protein，RIP），TCS成熟肽由247個氨基酸殘基組成，PI為9．4［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)TCS具有多種藥理學(xué)活性，可用于治療宮外孕、絨毛膜上皮細(xì)胞癌、惡性葡萄胎等，對于宮頸癌及白血病等腫瘤也有不同程度的抑制作用［2］。體外研究表明TCS還具有抗病毒（如 HIV），激發(fā)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）及協(xié)同進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等功效［3－4］。

雖然TCS具有多種藥理活性，但其明確的作用機(jī)制尚未完全闡明。近年來，對TCS抗腫瘤的作用機(jī)制存在多種不同觀點，一種觀點認(rèn)為，TCS作為RIP通過不可逆地抑制腫瘤細(xì)胞蛋白合成來抑制腫瘤生長；另有研究發(fā)現(xiàn)TCS可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡［2－3］；還有研究表明TCS的抗腫瘤作用并非單一途徑，而是通過聯(lián)合作用于腫瘤組織而殺傷腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，TCS的作用可能與其劑量有關(guān)，高劑量（＞100μg／mL）時，TCS可阻斷蛋白質(zhì)合成；中等劑量（5～50μg／mL）時，TCS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；低劑量（＜1μg／mL）時，TCS可誘導(dǎo)免疫抑制［5］。本文就近年來TCS抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展加以綜述。

TCS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡凋亡又稱為細(xì)胞的程序性死亡（program cell death，PCD），近年來發(fā)現(xiàn)多種化療藥物可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮藥理作用［6］。在研究TCS抗腫瘤作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)TCS可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡。黃益玲等［7］研究發(fā)現(xiàn)，TCS能誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞中包括NOP56、TNFSF10、CASP9、DFFB等在內(nèi)的62個與凋亡密切相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)；還能誘導(dǎo)包括COL9A3、MGST3、LGALS3BP等在內(nèi)的16個與細(xì)胞黏附及細(xì)胞間相互作用相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，但誘導(dǎo)凋亡的具體途徑和過程仍未闡明。

TCS通過依賴cAMP為第二信使的信號途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也有觀點認(rèn)為TCS主要通過下調(diào)Bcl－2基因來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl－2屬于抗凋亡基因，其表達(dá)增高可以維持線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，阻止線粒體膜電位下降和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白、Cyto－C和凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF），從而防止細(xì)胞凋亡。此外，Bcl－2能結(jié)合 Apaf－1和胱天蛋白酶－9（caspase－9），并維持其非活化狀態(tài)，阻止胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，防止細(xì)胞凋亡［8］。Wang等［3］研究發(fā)現(xiàn)利用環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件（cAMP response element，CRE）類似物阻斷cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element bound protein，CREB）作用于Bcl－2的基因位點，可以減弱TCS介導(dǎo)的Bcl－2基因表達(dá)下降。而p－CREB的過度表達(dá)可以上調(diào)Bcl－2的表達(dá)，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中這一表達(dá)的上調(diào)可以被TCS治療所抑制。由此可以作出推斷，TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過CREB介導(dǎo)來下調(diào)凋亡抑制基因Bcl－2的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)觀點認(rèn)為cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、進(jìn)而磷酸化CREB所不同，cAMP同樣可以激活PKC，后者作用于蛋白激酶ERK1／2和p38 MAPK，使之轉(zhuǎn)入細(xì) 胞核，磷酸化 CREB［9］。Li等［10］發(fā)現(xiàn)TCS誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能通過PKC起作用，因為使用PKC激動劑會使TCS的作用下調(diào)；反之，應(yīng)用PKC抑制劑會協(xié)同TCS的作用。［35S］GTPγS結(jié)合序列分析表明，TCS可以活化JAR細(xì)胞和K562細(xì)胞表面的G蛋白，進(jìn)而通過G蛋白來調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）的活性，Li等［11］研究發(fā)現(xiàn)TCS和高濃度的AC抑制劑都可通過劑量和時間依賴的方式來降低HeLa細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，因此活化的抑制性G蛋白（Gi）參與了TCS誘導(dǎo)的凋亡。由此推測，TCS作用于抑制性Gi，抑制AC下調(diào)cAMP，從而抑制PKC活化，并通過p38MAPK和ERK1／2信號通路下調(diào)CREB磷酸化，下調(diào)Bcl－2等與凋亡抑制有關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)凋亡。

TCS通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡TCS誘導(dǎo)凋亡的過程可以通過直接作用于線粒體而發(fā)生。Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)，TCS可以誘導(dǎo)人前髓細(xì)胞HL－60發(fā)生凋亡，作用過程中發(fā)現(xiàn)TCS使線粒體膜的通透性發(fā)生改變，接著從線粒體到細(xì)胞胞質(zhì)釋放細(xì)胞色素c和Smac，活化caspase－9，促進(jìn)凋亡復(fù)合物的形成，進(jìn)而通過線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)，使用caspase－9抑制劑z－LEHD－FMK 時，細(xì)胞的凋亡進(jìn)程被阻斷，說明caspase－9啟動的線粒體途徑參與到TCS誘導(dǎo)的凋亡［12］。此外，在研究TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，使用Fas單克隆抗體不會阻止TCS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此證明，TCS不是通過死亡受體途徑，而是通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)促發(fā)線粒體途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11－12］。此外，一些學(xué)者通過形態(tài)學(xué)觀察揭示了TCS線粒體凋亡通路。研究TCS作用于視網(wǎng)膜時發(fā)現(xiàn)，TCS可以選擇性地進(jìn)入并摧毀Müller細(xì)胞及色素上皮細(xì)胞，而對其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用輕微。TCS作用的視網(wǎng)膜細(xì)胞出現(xiàn)了核碎裂和核溶解，并出現(xiàn)了特征性的凋亡小體以及膨脹的線粒體。這些發(fā)現(xiàn)表明，TCS通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，而脹大的線粒體說明其凋亡過程可能依賴于線粒體［13］。

TCS通過影響細(xì)胞骨架來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征為表面微絨毛消失、細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)出泡形成凋亡小體。在核酸水平上，凋亡還可表現(xiàn)為核碎裂和核溶解。此外，凋亡還與細(xì)胞表達(dá)微管（microtubules，MT）、微絲（microfilaments，MF）的變化有關(guān)。Wang等［14］的研究還發(fā)現(xiàn)TCS誘導(dǎo)凋亡的過程中，解聚的MF在靠近細(xì)胞核和凋亡小體附近的粗糙細(xì)胞膜上堆積，緊接著在胞質(zhì)膜下有MT形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由此可見TCS誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞重組高度協(xié)調(diào)。在生理條件下，MF維持質(zhì)膜的完整性，凋亡過程中，MF解聚，MT對于維持質(zhì)膜的完整起到了重要的作用，TCS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡末期出現(xiàn)的環(huán)狀MT預(yù)示著細(xì)胞從凋亡向壞死過程的演進(jìn)［11］。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中，肌動蛋白和微管蛋白基因受到了不同程度的調(diào)控——γ肌動蛋白mRNA下降速度快于β肌動蛋白，α和β微管蛋白mRNA在Hela細(xì)胞凋亡的晚期依次下調(diào)。這些結(jié)果都表明，TCS誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡伴隨著特殊的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變，同時肌動蛋白和微管蛋白基因在細(xì)胞凋亡的不同階段表達(dá)受到抑制［14］。然而，TCS是否通過MF和MT影響細(xì)胞骨架來啟動細(xì)胞凋亡，還有待進(jìn)一步研究探索。

TCS作為RIP發(fā)揮抗腫瘤作用RIP具有RNA N－C糖苷酶活性，能水解真核細(xì)胞核糖體28SrRNA的4324位上腺苷酸的N－C糖苷鍵，釋放出1個腺嘌呤堿基，使核糖體不可逆失活，從而抑制蛋白質(zhì)合成。RIP可以分為2種類型：Ⅰ型RIP由單鏈組成，僅具有核糖體抑制活性，TCS是典型的Ⅰ型RIP；Ⅱ型RIP由2條多肽鏈組成，分別稱為A鏈和B鏈，A鏈從結(jié)構(gòu)及功能上均與Ⅰ型RIP相似，B鏈具有凝集素樣結(jié)構(gòu)，可特異地與真核細(xì)胞表面的半乳糖受體結(jié)合，有利于RIP進(jìn)入細(xì)胞，其代表植物蛋白是蓖麻素蛋白（ricinus communis agglutinin，RCA）［15］。

TCS的選擇性作用機(jī)制Sha等［15］將RCA的A鏈與TCS對照研究時發(fā)現(xiàn)，體外TCS的毒性遠(yuǎn)低于RCA；體內(nèi)較小劑量的RCA就會引起壞死和炎癥，而TCS即使是較大劑量，也僅是引起視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。Sha等［13］研究發(fā)現(xiàn)RCA毒性很強(qiáng)，對于哺乳動物細(xì)胞的殺傷幾乎不具有選擇性。相反，TCS通常具有選擇性，其毒性作用主要針對來源于滋養(yǎng)層細(xì)胞的絨毛膜癌及來源于骨髓造血干細(xì)胞的各種白血病，而對正常組織及其他組織的毒性較弱。TCS這一選擇性有利于其應(yīng)用于臨床，而TCS選擇作用的機(jī)制可能與其進(jìn)入細(xì)胞的途徑相關(guān)。

目前研究發(fā)現(xiàn)TCS可通過兩條途徑進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用：其一，通過TCS與磷脂膜相互作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；其二，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，受體主要是低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）［16］。Jiao等［17］研究發(fā)現(xiàn)，TCS通過絨毛膜細(xì)胞表面的JAR和BEWO細(xì)胞上的LRP1內(nèi)吞進(jìn)入到靶細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮作用。而在HeLa細(xì)胞表面未發(fā)現(xiàn)LRP1，這可以解釋為什么HeLa細(xì)胞相比于JAR和BEWO細(xì)胞對TCS不敏感，可能是因為HeLa細(xì)胞不能通過有效的內(nèi)吞途徑來攝取TCS。Li等［18］還發(fā)現(xiàn)，胃癌SGC－7901細(xì)胞相比于正常的胃黏膜上皮細(xì)胞對TCS更敏感；研究同時發(fā)現(xiàn)TCS誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性在肝HepG2細(xì)胞上不如在JAR細(xì)胞上明顯，其機(jī)制可能也與LRP1介導(dǎo)的受體內(nèi)吞有關(guān)。Zhao等［19］研究TCS抗HIV作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，與RCA通過Sec61蛋白孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不同，TCS能直接穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。TCS通過膜表面的脂質(zhì)進(jìn)入，HIV－1包膜上存在大量脂質(zhì)，因此可以確信TCS通過上述途徑進(jìn)入HIV－1內(nèi)發(fā)揮作用。TCS通過非特異性受體進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用的研究解釋了TCS可特異性作用于腫瘤等靶細(xì)胞和靶組織，而對于正常組織和其他組織無作用。但仍存在一些疑問，如受體介導(dǎo)的內(nèi)吞為什么可以躲過溶酶體的作用；一些正常的人體組織細(xì)胞表面有大量LRP1，但為什么對TCS同樣不敏感，這些問題有待于進(jìn)一步研究探索。

TCS抑制蛋白質(zhì)合成與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系早期認(rèn)為TCS具有N－糖苷酶活性，可以阻斷蛋白質(zhì)合成，后又發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。兩者之間是否存在相關(guān)性尚不明確［11］。在研究其他RIP誘發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，RIP的N－糖苷酶活性可以介導(dǎo)核糖體毒性應(yīng)激反應(yīng)（ribotoxic stress response，RSR），從而激活 SAPK／JKN 和p38信號通路，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡［20］。然而之前有研究報道，TCS 可以抑制 PKC／ERK1／2 和 p38 MAPK信號通路，導(dǎo)致HeLa細(xì)胞的生長抑制［9］。由此推斷，TCS可能并未參與RSR，也沒有通過N－糖苷酶活性來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在TCS誘導(dǎo)人前髓細(xì)胞HL－60發(fā)生凋亡的過程中，TCS處理1．5h后發(fā)生線粒體膜通透性改變，但其是否發(fā)生在蛋白質(zhì)合成的抑制之前尚不明確［11］。

TCS的其他抗腫瘤作用機(jī)制最近研究發(fā)現(xiàn)TCS可以用于治療慢性髓細(xì)胞性白血病。慢性髓細(xì)胞性白血病的特征為染色體t（9；22）發(fā)生相互易位，稱為費(fèi)城染色體。其中Bcr－Abl基因發(fā)生了融合，融合基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯持續(xù)激活了原癌基因p210 Bcr－Abl，也導(dǎo)致了ABL酪氨酸激酶的活性失去控制。甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，IM）是一種酪氨酸酶阻斷劑，也是治療慢性髓細(xì)胞性白血病最有效和最特異的藥物。然而臨床研究表明，IM不能完全清除惡性瘤變，而且長期使用的患者會對IM產(chǎn)生抵抗。TCS可以協(xié)同IM來誘導(dǎo)K562細(xì)胞生長停滯。這一作用可以理解為TCS抑制融合基因Bcr－Abl轉(zhuǎn)錄表達(dá)的酪氨酸激酶，并且下調(diào)原癌基因p210 Bcr－Abl水平，抑制如PKC和NF－κB等一些信號分子。而PKC和NF－κB廣泛參與細(xì)胞的增殖及其調(diào)控［21］。一些研究發(fā)現(xiàn)，使用NF－κB的抑制劑（如地塞米松）可以增強(qiáng)TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，由此推測NF－κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可以上調(diào)一些抗凋亡基因（如Bcl－2）［18］。

此外，在研究TCS、米非司酮、順鉑在卵巢惡性腫瘤治療中的作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，與順鉑和米非司酮不同，TCS的抗腫瘤作用機(jī)制之一是能夠明顯下調(diào)腫瘤組織中 HLA－G 和 HLA－E的表達(dá)水平。HLA－G和HLA－E是非經(jīng)典HLA－Ⅰ分子，它們在腫瘤組織表面表達(dá)的上調(diào)可以抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞對于腫瘤組織的殺傷作用，從而使腫瘤組織逃過機(jī)體的免疫監(jiān)視作用［22］。

結(jié)語TCS可以通過多種途徑來殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞生長，一方面可以發(fā)揮RIP活性，另一方面誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡，此外還可以通過其他多種途徑來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。然而，在TCS的研究過程中尚存在一些問題有待解決。例如，TCS發(fā)揮的RIP活性與其誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，如何通過對TCS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾來提高其生物活性并降低過敏原性，TCS誘導(dǎo)凋亡的通路等。相信隨著這些問題的解決，TCS可以更好地應(yīng)用于臨床抗腫瘤的治療與研究。

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