常盼盼，鐘小仙，劉智微

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，江蘇 南京210095）

＊海濱雀稗（Paspalumvaginatium，Seashore paspalum）為禾本科（Graminea）雀稗屬（Paspalum）植物，原產(chǎn)于美洲，分布于世界熱帶、亞熱帶，尤其美洲熱帶之海岸，為潮間帶草灘植被的主要組分，能在復(fù)雜的逆境條件下生長，其抗性主要表現(xiàn)在耐鹽、耐澇、抗旱、耐踐踏等方面，是目前已知耐鹽能力最強(qiáng)的草坪草種。其葉色翠綠，景觀效果優(yōu)于狗牙根（Cynodonspp.）和假儉草（Eremochloaophiuroides），已成為21世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ呐拘筒萜翰莘N［1－7］。美國較早開展了海濱雀稗品種的選育工作，20世紀(jì)末海濱雀稗品種Adalayd從美國引進(jìn)中國，1998年自深圳的觀瀾湖高爾夫球場引至江蘇省，試種結(jié)果表明，Adalayd能生長在全鹽含量為0.8%～1.0%的濱海鹽土，海水短期淹沒、較長期浸泡均能忍受，抗寒性強(qiáng)，綜合性狀優(yōu)，在江蘇省連云港以南地區(qū)可自然越冬。鄒軼等［8］及景艷霞和袁慶華［9］系統(tǒng)研究了海鹽脅迫對海濱雀稗Adalayd生長及植株體內(nèi)陽離子含量的影響，初步明確了鹽脅迫下海濱雀稗不同于紫花苜蓿（Medicagosativa）的陽離子積累規(guī)律。鄒軼等［10］系統(tǒng)研究了海鹽脅迫對海濱雀稗Adalayd植株形態(tài)和生長的影響，并進(jìn)一步明確了Adalayd對海鹽脅迫的生理響應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，在江蘇省和浙江省新圍墾海涂，初步建立了海濱雀稗Adalayd種莖直播和草塊直鋪技術(shù)體系，因其耐鹽性強(qiáng)、景觀效果好，在長江中下游及其以南地區(qū)正在備受關(guān)注。但由于海濱雀稗Adalayd與其他二倍體海濱雀稗種質(zhì)一樣，由于自交不親和［11，12］，只能以無性繁殖方式擴(kuò)繁，明顯影響海涂大面積草地建植以及沿海開發(fā)區(qū)大面積廠區(qū)和邊坡地綠化的成本。

截至目前，全世界只有一個(gè)商品化種子直播型海濱雀稗雜交品種“Sea Spray”（Q36313×Hyb－7），由美國純種子測試機(jī)構(gòu)（Pure Seed Testing）與喬治亞大學(xué)研究基金會(huì)（University of Georgia Research Foundation）合作培育而成［13］。據(jù)報(bào)道，2005年海濱雀稗雜交品種“Sea Spray”已正式引入我國，但尚未見其在江浙海涂推廣應(yīng)用，推測可能與生態(tài)適應(yīng)性和抗寒性有關(guān)。近年來，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鐘小仙等［14］一直致力于可自交結(jié)實(shí)型海濱雀稗新品種選育，以幼穗離體培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織為材料，從經(jīng)一定濃度和時(shí)間的秋水仙素誘導(dǎo)處理獲得的再生植株上，收獲到了體細(xì)胞突變體M1種子，M1種子均能正常發(fā)芽成苗。本研究通過比較能自交結(jié)實(shí)的海濱雀稗突變體SP2008－3和對照品種Adalayd的植物學(xué)特征和葉片氣孔特性，結(jié)合細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定和DNA分子檢測，探索海濱雀稗突變體SP2008－3的特異性，為育成具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)、可種子繁殖的海濱雀稗新品種提供基礎(chǔ)保證［15］，為大面積鹽漬土利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海濱雀稗品種Adalayd，2n＝20，為自交不親和二倍體，20世紀(jì)末從美國夏威夷引進(jìn)我國，2006年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從杭州白云草業(yè)研究所有限公司引進(jìn)；海濱雀稗突變體SP2008－3，以Adalayd幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的顆粒狀愈傷組織為材料［16］，經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)獲得了再生植株，2009年，經(jīng)田間結(jié)實(shí)性鑒定，獲得了可自交結(jié)實(shí)的再生植株并收獲到種子，2010年4月播種出苗后植株成坪。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物學(xué)特征的觀測 每種材料分別選取20個(gè)匍匐莖，測量從頂端向后第4個(gè)節(jié)的節(jié)間長度及直徑；選取20個(gè)直立莖，測量中間1個(gè)節(jié)的節(jié)間長度及直徑；選取30片新出的第3片完全展開葉，測量葉片長度和寬度。

1.2.2 葉片氣孔特性的觀測 分別選取2種供試材料新出的第3片完全展開葉中間部位長1 cm、寬為葉片自然寬度的部分葉片，采用離析法［17］，浸泡在等量的30%過氧化氫－醋酸溶液中，在60℃烘箱內(nèi)放置24 h，待葉肉組織和表皮細(xì)胞分離后，把離析材料取出，放入裝有適量蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用鑷子分離葉片上、下表皮，1%番紅染色1～2 min，制成臨時(shí)裝片，在OLYMPUS CX31光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

采用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（JD801，江蘇捷達(dá)軟件工程有限公司，南京）測定氣孔的密度、寬度和長度。每種供試材料選擇30個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)氣孔器數(shù)目，計(jì)算其密度。每種供試材料拍攝15個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)氣孔器長度和寬度。氣孔器長度是指氣孔關(guān)閉狀態(tài)下啞鈴形氣孔器的長度；氣孔器寬度是氣孔關(guān)閉狀態(tài)下垂直于啞鈴形氣孔器的最寬值［18］。

1.2.3 細(xì)胞學(xué)鑒定 分別取海濱雀稗SP2008－3和Adalayd莖節(jié)，將其放入1／2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)生根，待根長至1～2 cm時(shí)，于上午9：00前后取出切下根尖，經(jīng)自來水沖洗后加入到裝有預(yù)處理液8－羥基喹啉的離心管中，置于4℃冰箱中處理2～4 h。材料預(yù)處理后用自來水沖洗30 min后用卡諾氏固定液于冰箱中固定24 h，固定后的材料用蒸餾水沖洗后放入裝有預(yù)熱的1 mol／L鹽酸的離心管中于60℃恒溫水浴中解離4～6 min，解離后的材料用蒸餾水沖洗30 min后，置于卡寶品紅中染色30 min。染色后滴1滴45%冰醋酸于載玻片壓片觀察，在顯微鏡下鏡檢。在實(shí)際操作中，不同學(xué)者所統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的數(shù)目有很大差別，一般認(rèn)為85%以上的細(xì)胞具有相同染色體數(shù)時(shí)，方能確定該植物染色體數(shù)［19，20］。本試驗(yàn)選擇25個(gè)染色體分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行觀察、拍照和統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。

1.2.4 RAPD分子鑒定 取海濱雀稗體細(xì)胞突變體SP2008－3、原始對照Adalayd（CK1）及其幼穗離體培養(yǎng)再生植株（CK2）的幼嫩葉片，采用Karroten公司生產(chǎn)的植物DNA提取試劑盒（Karroten TM Plant Genomic DNA Extraction kit）提取DNA。選取RAPD隨機(jī)引物34條委托上海生工生物工程有限公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)在Ta KaRa公司PCR Thermal Cycler D上進(jìn)行，反應(yīng)體積25μL，內(nèi)含10×Buffer（含 Mg2＋），10μmol／L d NTP，Taq DNA聚合酶0.3μL，引物0.5μmol／L，總DNA模板1μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共45個(gè)循環(huán)，最后再72℃ 延伸7 min，4℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳分離，talon全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。對表現(xiàn)多態(tài)性的引物，重復(fù)3次，選擇重復(fù)性好的引物進(jìn)行分析。

隨機(jī)選用34個(gè)合成引物對海濱雀稗突變體SP2008－3、對照Adalayd（CK1）和Adalayd幼穗離體培養(yǎng)再生植株（CK2）進(jìn)行了RAPD－PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，篩選出2個(gè)多態(tài)性和重復(fù)性好的引物S369和S131。S369序列為5′CCCTACCGAC3′；S131序列為5′TTGGTACCCC3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物學(xué)特征的比較

與Adalayd相比，SP2008－3匍匐莖節(jié)間長度及匍匐莖直徑分別減小34.77%和11.76%，差異顯著（P＜0.05）；葉片長度及寬度分別顯著增加22.55%和11.11%；直立莖縮短變粗，但與Adalayd無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

在統(tǒng)計(jì)的25個(gè)染色體分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相細(xì)胞中，SP2008－3中有22個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)目為20條，占所統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)的88%，比例超過了85%，據(jù)此確定海濱雀稗SP2008－3的體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝20（圖1）。

表1 SP2008－3與Adalayd植物學(xué)特征比較Table 1 Comparison on phytological characteristics between SP2008－3 and Adalayd

圖1 海濱雀稗突變體2008－3（A）與Adalayd（B）有絲分裂中期染色體Fig.1 Chromosome of mutant SP2008－3（A）and Adalayd（B）at mitotic metaphase

2.3 RAPD分子鑒定

引物S369序列為5′CCCTACCGAC3′，與Adalayd（CK1、CK2）相比，SP2008－3缺少1條約3 000 bp的條帶和1條約800 bp的條帶；引物S131序列為5′TTGGTACCCC3′，與 Adalayd（CK1、CK2）相比，SP2008－3植株缺少1條約200 bp的條帶（DNA Marker 5 000 bp）。再用重復(fù)性較好的引物S369對所有3個(gè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不僅條帶清晰，而且經(jīng)3次重復(fù)表現(xiàn)穩(wěn)定。RAPD分析結(jié)果顯示，對照材料海濱雀稗Adalayd（CK1、CK2）均含有約1 100 bp的條帶，而SP2008－3則缺失（圖2）。

2.4 葉片表皮氣孔特性的比較

與Adalayd相比，海濱雀稗體細(xì)胞突變體SP2008－3葉片上表皮氣孔密度增加20.58%，氣孔器長度減小9.64%，氣孔器寬度減小6.31%，差異均達(dá)顯著水平。海濱雀稗體細(xì)胞突變體SP2008－3葉片下表皮氣孔器密度比Adalayd增加40.62%，氣孔器長度和氣孔器寬度分別比Adalayd減小6.73%和5.33%，且均呈顯著性差異（表2）。

3 討論

形態(tài)學(xué)鑒定是比較傳統(tǒng)、常規(guī)的品種鑒定技術(shù)［21］。劉建秀等［22］根據(jù)狗牙根匍匐莖節(jié)間長和節(jié)間直徑、葉長和葉寬等19個(gè)外部性狀對華東地區(qū)34個(gè)點(diǎn)上的88份狗牙根材料進(jìn)行了遺傳多樣性的研究，結(jié)果表明，華東地區(qū)狗牙根可分為5個(gè)類型，即矮細(xì)型、矮粗型、斜細(xì)型、斜粗型和直立型。金洪等［23］通過對結(jié)縷草（Zoysiajaponica）葉寬、匍匐莖中部節(jié)間長、匍匐莖的直徑、穗長等表型性狀研究了結(jié)縷草居群內(nèi)部的變異類型，將20個(gè)居群分為8類。本研究通過對海濱雀稗體細(xì)胞突變體SP2008－3和Adalayd植物學(xué)特性比較發(fā)現(xiàn)，SP2008－3除了可自交結(jié)實(shí)的顯著特性外，匍匐莖節(jié)間長度、匍匐莖莖粗均較Adalayd顯著減??；葉片長度和寬度均顯著增加。這表明，經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)后的SP2008－3在表型性狀上與對照材料Adalayd存在顯著差異。

葉片是進(jìn)行光合作用、呼吸作用、蒸騰作用等生理代謝的主要器官，葉解剖結(jié)構(gòu)與植物生長相關(guān)性密切，因此，葉解剖結(jié)構(gòu)可作為良種篩選的又一輔助指標(biāo)［24，25］。氣孔在調(diào)控水分丟失和光合作用之間總是處于一種折中狀態(tài)［26］，氣孔器密度的增加有利于提高凈光合速率和品種耐濕能力，氣孔器減小則有利于減小葉片蒸騰速率［25，27，28］。與對照品種Adalayd相比，海濱雀稗突變體SP2008－3葉片上、下表皮氣孔器密度顯著增加，氣孔器長度，氣孔器寬度均顯著減小。氣孔器特性改變與生理代謝的相關(guān)性正在進(jìn)一步研究。

圖2 突變體SP2008－3 RAPD多態(tài)性分析Fig.2 RAPD analyses of mutant SP2008－3

表2 SP2008－3與Adalayd氣孔器特性的比較Table 2 Comparison of stomata characteristic between SP2008－3 and Adalayd

在植物誘變育種過程中，秋水仙素作為一種常用的藥劑，因作用時(shí)期不同，誘變機(jī)理和結(jié)果不同，適宜濃度的秋水仙素能破壞紡錘絲的形成，使分生細(xì)胞復(fù)制的染色體在細(xì)胞分裂時(shí)不能分向兩極，從而導(dǎo)致新生細(xì)胞的染色體加倍［29］；而秋水仙素的作用時(shí)期為DNA復(fù)制期，其通過植物細(xì)胞在復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程中滲入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)生堿基的替代或嵌入堿基之間，造成染色體變異，進(jìn)而發(fā)生復(fù)制或轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致基因突變［30］。對海濱雀稗SP2008－3體細(xì)胞染色體初步計(jì)數(shù)結(jié)果表明，海濱雀稗突變體SP2008－3的體細(xì)胞染色體數(shù)目與對照品種Adalayd相同，為2n＝20，但是其染色體大小、隨體著絲點(diǎn)位置等是否不同于Adalayd，又或者其在細(xì)胞水平上未發(fā)生改變［31，32］，尚有待于進(jìn)一步研究。

隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的迅速發(fā)展，植物品種鑒定的方法已從簡單、粗放的形態(tài)學(xué)鑒定進(jìn)入到了分子生物學(xué)鑒定水平。常見的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等［33］。其中RAPD具有操作簡便快速，對DNA的純度要求不高，DNA用量少，檢測位點(diǎn)多，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［31，33］。解新明等［34］利用RAPD技術(shù)將來自廣東省海濱雀稗的3個(gè)野生居群和1個(gè)草坪型栽培品種分為兩類。本研究中海濱雀稗SP2008－3與對照Adalayd相比，缺失了1條約1 100 bp的條帶，進(jìn)一步表明在DNA水平上海濱雀稗SP2008－3發(fā)生了變異。這一結(jié)果與Martelotto等［35］對2個(gè)海濱雀稗種的同源多倍體RAPD檢測結(jié)果相似，基因重組造成條帶缺失的頻率顯著高于獲得新條帶的概率。

［1］ 解新明，盧小良.海雀稗種質(zhì)資源的優(yōu)良特性及其利用價(jià)值［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25：64－67.

［2］ Duncan R R，Carrow R N.SeashorePaspalum－the Environmental Turfgrass［M］.Hoboken：John Wiley＆Sons，Inc.，1999.

［3］ Peacock C H，Dudeck A E.Physiological and growth responses of seashore paspalum to salinity［J］.HortScience，1985，20（1）：111－112.

［4］ Duncan R R.Seashore paspalum may be grass for the year 2000［J］.Southern Turf Management，1994，5：31－32.

［5］ Huang B，Duncan R R，Carrow R N.Drought－resistance mechanisms of seven warn－season turfgrass under surface soil drying：I.Shoot response［J］.Crop Science，1997，37（6）：1858－1863.

［6］ 賀小霞，劉一明，王兆龍.海濱雀稗栽培品種的形態(tài)特征與AFLP分子標(biāo)記分析［J］.草地學(xué)報(bào)，2011，19（1）：164－170.

［7］ 鄭軼琦，臧國長，郭海林，等.假儉草雜交后代生殖性狀遺傳及相關(guān)性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：283－289.

［8］ 鄒軼，顧洪如，鐘小仙，等.海鹽脅迫對海濱雀稗生長及植株體內(nèi)陽離子含量的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，26（4）：117－120.

［9］ 景艷霞，袁慶華.NaCl脅迫對苜蓿幼苗生長及不同器官中鹽離子分布的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：134－139.

［10］ 鄒軼，顧洪如，鐘小仙，等.海鹽脅迫對海濱雀稗生長及植株體內(nèi)陽離子含量的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，24（6）：117－120.

［11］ Espinoza F，Quarin C L.Cytoembryology ofPaspalumchaseanumand sexual diploid biotypes of two apomicticPaspalumspecies［J］.Australian Journal of Botany，1997，45：871－877.

［12］ Carpenter J A.Production and use of seed in seashore paspalum［J］.Australian Institute of Agricultural Science and Technology，1958，24：252－256.

［13］ Fricker C，Wipff J K，Duncan R R.Hybrid seashore paspalum available from seed called“Sea Spray”［P］.United States Patent：7262341B1，2007－08－28.

［14］ 鐘小仙，吳娟子，劉智微，等.自交不結(jié)實(shí)海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細(xì)胞突變體的篩選方法［P］.中國專利：201110074147.1，2011－03－28.

［15］ 馬金星，張吉宇，單麗燕，等.中國草品種審定登記工作進(jìn)展［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（1）：206－213.

［16］ 梁流芳，佘建明，吳瑛瑛，等.海雀稗幼穗離體培養(yǎng)植株再生［J］.草地學(xué)報(bào)，2008，16（6）：590－593.

［17］ 孫同興，江幸山.簡便有效的葉表皮離析方法——過氧化氫－醋酸法［J］.廣西植物，2009，29（1）：44－47.

［18］ 傅志強(qiáng)，黃璜，何保良，等.水稻葉片氣孔特性及其相關(guān)性［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，33（6）：646－650.

［19］ 虞道耿，劉國道，白昌軍，等.熱研11號黑籽雀稗染色體核型分析［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，27（1）：109－113.

［20］ 李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：1－60.

［21］ 張建成，江玉萍，王傳堂，等.花生品種鑒定技術(shù)研究進(jìn)展［J］.花生學(xué)報(bào)，2006，35（2）：24－28.

［22］ 劉建秀，賀善安，劉永東，等.華東地區(qū)狗牙根形態(tài)分類及其坪用價(jià)值［J］.植物資源與環(huán)境，1996，5（3）：18－22.

［23］ 金洪，韓烈保，張永明.中國結(jié)縷草居群形態(tài)變異分析［J］.中國草地，2004，26（2）：50－56.

［24］ 覃秀菊，李鳳英，何建棟，等.廣西茶樹新品種品系葉片解剖結(jié)構(gòu)特征與特性關(guān)系的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（10）：36－39.

［25］ 李宗艷，肖娟，蒙進(jìn)芳，等.麗江牡丹和中原牡丹葉片結(jié)構(gòu)微形態(tài)比較［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（1）：115－120.

［26］ Casson S A，Hetherington A M.Evironmental regulation of stomatal development［J］.Current Opinion in Plant Biology，2010，13（1）：90－95.

［27］ Aschan G，Pfanz H，Vodnik D，etal.Photosynthetic performance of vegetative and reproductive structures of green hellebore（HelleborusviridisL.agg.）［J］.Photosynthetica，2005，43（1）：55－64.

［28］ 游明安，蓋鈞鎰，馬育華.田間條件下大豆氣孔特性的初步研究［J］.大豆科學(xué)，1992，11（2）：152－158.

［29］ 鄭永強(qiáng)，徐坤.秋水仙素在植物體細(xì)胞染色體加倍中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2003，19（5）：89－91.

［30］ 徐明，路鐵剛.植物誘變技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1（2）：90－97.

［31］ 甘玲，湯浩茹，董曉莉.梨種類和品種鑒定研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（5）：302－307.

［32］ 陳智勇，胡忠紅，蔣建雄，等.早熟禾族3種基因型草坪草的染色體核型分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（6）：281－285.

［33］ 李志勇，孫啟忠，李鴻雁，等.分子標(biāo)記技術(shù)在牧草種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用［J］.草原與草坪，2010，30（5）：91－96.

［34］ 解新明，盧小良，孫雄松，等.海雀稗種質(zhì)資源分子標(biāo)記的遺傳多樣性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25：10－15.

［35］ Martelotto L G，Ortiz J P A，Stein J，etal.Genome rearrangements derived from autopolyploidization inPaspalumsp.［J］.Plant Science，2007，172：970－977.