董軍磊，歐 元，李彩霞，徐建棟，葉 健

（1.中國人民公安大學，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.北京理工大學，北京 100081）

1 引言

聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction, PCR)是1985 年美國 Cetus 公司的 Mullis等人發(fā)明的一種具有里程碑意義的新技術，使得核酸的體外無限擴增成為現(xiàn)實。隨著第一臺PCR熱循環(huán)儀的問世，PCR技術作為一種重要的手段，被廣泛地應用到分子生物學和基因工程實驗室、疾病檢測、臨床應用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定、新藥開發(fā)和工農(nóng)業(yè)制品的開發(fā)等方面[1]。

得益于陣列毛細管電泳等先進檢測技術的發(fā)展，人類基因組計劃提前完成，這讓人們越來越認識到檢測工具的重要性。隨著后基因時代的到來，待檢測樣本量日益增大，這需要對大量樣本進行快速PCR，同時新的分析方法和檢測技術也推動檢測儀器向微型化、自動化、快速化、集成化、便攜化發(fā)展。1990年，Manz和Widmer把當時微電子領域已經(jīng)發(fā)展成熟的微電機加工技術(micro-electronic mechanical system，MEMS)作為加工平臺來實現(xiàn)全部分析功能在芯片上的微型化，首次提出了微全分析系統(tǒng)（Micro Total Analysis System，μ-TAS ）的概念[2]，在此后的二十幾年中發(fā)展成為世界上最前沿的科技領域之一。目前其核心技術即是以微流控技術（Microfluidics）為基礎的微流控芯片。微流控PCR芯片是一種典型的用于DNA擴增反應的微流控芯片，它采用先進的MEMS技術，最大限度地將生化分析的操作步驟集成到芯片上，與常規(guī)熱循環(huán)儀相比，具有微型化、消耗試劑少，升降溫速度快、易于與其他裝置集成等特點，成為芯片研究領域的熱點。

2 微流控PCR芯片研究進展

2.1 制作材料

用于制作PCR芯片的材料主要有單晶硅、石英和玻璃、高分子聚合材料, 如光膠SU-8、聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane, PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate,PMMA)等。單晶硅是最早適用的芯片基材，加工工藝及相關設備完善，但硅材料易碎、價格貴、抗腐蝕性能不夠好, 且對PCR反應抑制作用[3]。玻璃和石英有著很好的抗腐蝕性，且廉價易得。由于其制作工藝復雜，在一定程度上影響了其應用。聚合物材料品種多，價廉，無毒、易于大批量生產(chǎn)。其中PDMS是目前最常用的聚合物材料，因為它價格便宜，加工工藝簡單，又有很好生物相容性和熱穩(wěn)定性。

2.2 制作方法

PCR芯片的制造，與多數(shù)微流控芯片一樣，依據(jù)材料的不同有著不同的制作工藝。對于硅、玻璃等材料為主的微流控芯片主要采用光刻和蝕刻技術進行加工, 通過光刻和蝕刻技術可以在基底材料上獲得各種形狀和大小的微管道。使用LIGA(Lithographie、Galvanoformung、Abformung) 技術可以達到高分辨率刻蝕，但對設備和環(huán)境要求也非常高。聚合物芯片上的微結(jié)構(gòu)一般采用模塑法、注塑法、熱壓法、軟光刻(soft lithography)、激光燒蝕法、LIGA技術等方法[4]制成。

2.3 加熱方式

微流控PCR芯片的加熱方式一般根據(jù)加熱源與微反應室的相對位置分為接觸式加熱和非接觸式加熱。

2.3.1 接觸式加熱

現(xiàn)有微流控PCR芯片多數(shù)都采用接觸式加熱方式，主要有分體式和集成式兩種。分體式加熱方式最簡單的就是采用導熱性好的銅塊[5-7]或鋁塊[8-9]。另外一種常用的是采用珀耳帖（Peltier）半導體加熱制冷片[8,10]，其上面為熱面，下面為冷面，通過改變電流方向來使冷熱面互換，溫差可達60℃。還有報道通過化學反應進行加熱和冷卻[11]。分體式加熱往往是外置的，加工簡單，成本小，但熱容較大，加熱和冷卻速度慢，不易于集成微型化。

相對于分體式加熱方式，集成式加熱方式是利用沉積、濺射等微加工技術直接將加熱原件和測溫原件集成在微流控芯片上，熱容小，耗能低，集成化程度高。主要采用金屬薄膜加工工藝，最常用的金屬是鉑（Pt），一般現(xiàn)在微反應室底部沉積一層鈦或鉻，實現(xiàn)金屬鉑與硅或玻璃的良好接觸。也有用鋁[12]、銀[13]和鎢[14]加熱。氧化銦錫（ITO）[15-16]具有良好的透光性，也常被濺射到玻璃基片上，通過光刻技術形成加熱器和溫度傳感器。

2.3.2 非接觸式加熱

采用非接觸式熱循環(huán)系統(tǒng)可提高熱交換效率，不影響芯片加工。常用的非接觸熱源有紅外線[17-18,37,46]、熱空氣[19]、激光[20]、微波[23]等。

2.4 微流控PCR芯片的分類

目前，根據(jù)熱循環(huán)方式的不同，微流控PCR芯片主要分為靜態(tài)腔室PCR芯片（Static chamber PCR）和連續(xù)流PCR芯片（Continuous-flow or flow-through PCR）兩種模式。

2.4.1 靜態(tài)腔室PCR芯片

靜態(tài)腔室PCR芯片與傳統(tǒng)PCR儀的工作原理類似，通過加熱裝置動態(tài)的溫度變化，促使微室腔內(nèi)的混合試樣完成聚合酶鏈反應；由于腔室的體積小至幾微升，因此熱容非常小，可以實現(xiàn)快速加熱和制冷，并且有利于實現(xiàn)多功能集成和制造。自從1993年Northrup[21]等采用MEMS技術首次在硅微流控芯片上成功實現(xiàn)靜態(tài)PCR擴增以來，許多研究者從事靜態(tài)腔室PCR芯片的研究工作，由于這種方法熱循環(huán)次數(shù)不受限制，可以根據(jù)不同需要設計不同類型的腔室。

Poser等[22]在硅片上加工了2到10個微升級（5-10μl）的PCR芯片，并用淀積的方法在微芯片上集成微加熱片和溫度傳感器作為微控溫系統(tǒng)。升溫速度為80℃/s，降溫速度為40℃/s，溫度變化可精確控制在0.1℃/s。Oh等[23]在玻璃上制作了4個約0.95μl的多微反應腔芯片。Shaw等[24]在玻璃制作了含有0.7μl微反應腔室的微流控PCR芯片，采用非接觸式微波作為加熱源,結(jié)合冷空氣降溫，熱循環(huán)的升降溫速率達65℃/s，溫控偏差±0.5℃。Sundberg[25]等在塑料光盤制作1000個納升級的微孔內(nèi)，孔的容積為33μl，用離心法進行樣品分裝，用快速空氣加熱和實時熒光進行檢測。完成循環(huán)用時33s，擴增效率達94%；300bp的質(zhì)粒DNA樣品在58-1000個孔內(nèi)完成擴增和分析用時在50min以內(nèi)，證明這種簡易的圓盤PCR裝置可以減少一次性品消耗和熱循環(huán)時間。

2.4.2 連續(xù)流PCR芯片

1998年，Kopp[26]等首次報道了一種樣品可在不同溫度的恒溫區(qū)間內(nèi)連續(xù)流動的PCR芯片，三個溫度區(qū)(95℃、77℃和60℃)由三個恒溫銅塊來實現(xiàn)，由驅(qū)動泵驅(qū)動PCR反應試樣沿微通道順序流經(jīng)這三個溫度區(qū)，并精確控制流速。在流動過程中實現(xiàn)變性、退火、延伸反應，完成擴增。這種連續(xù)流PCR不像靜態(tài)腔PCR那樣依賴溫度隨時間的變化，而是靠流過不同的恒溫區(qū)實現(xiàn)擴增。PCR的擴增效率取決于混合試樣在某一溫區(qū)停留的實踐，即該溫區(qū)相應微通道的長度、通道截面積及混合試樣的流速。由于連續(xù)流PCR芯片主要依靠流路微通道實現(xiàn)反應，具有熱傳遞和熱循環(huán)速度快的優(yōu)點。但這中逶迤式連續(xù)流PCR芯片的循環(huán)次數(shù)是固定的，不便于靈活控制。

2003年Obeid 等[5]研制了一種連續(xù)流微流控型PCR 芯片，使其不僅能夠?qū)崿F(xiàn) DNA 的擴增，還可以在芯片中完成 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄過程，進而能夠用于RNA 的逆轉(zhuǎn)錄 PCR 過程；同時，在該設計中，芯片的微通道在不同位置處開設出口，使得該芯片PCR循環(huán)次數(shù)能夠在20、25、30、35、40之間選擇。該設計方案極大地提高了微流控型 PCR 芯片的應用范圍，使其不必拘泥于過于死板的循環(huán)次數(shù)的限制。Chiou等[27]、Frey等[6]分別報道了一種往復式通道，通過對流體的雙向驅(qū)動系統(tǒng)，控制混合試樣在不同恒溫區(qū)之間來回反復流動而實現(xiàn)PCR擴增，這樣既減少了通道長度，節(jié)省了空間，又控制了循環(huán)次數(shù)。

連續(xù)流PCR芯片在驅(qū)動力方面，很多研究者[28-31]報道一種使用不同溫區(qū)下的溫差所產(chǎn)生的對流浮力（Buoyancy force）進行管內(nèi)反應液驅(qū)動的方法，并利用此原理制作出了快速，便攜的微流控PCR擴增裝置，成功進行了DNA的擴增。但是對流浮力驅(qū)動的芯片，對擺放位置要求較高[1]，且擴增效率有待進一步研究[29]。

對于上述類型連續(xù)流PCR芯片，微通道中只有單相的反應混合液流動，連續(xù)進行多種樣本擴增時將會造成樣本相互污染、管壁吸附、蒸發(fā)和擴散稀釋[32]。劉金華[33]設計一種螺旋式連續(xù)流PCR芯片實現(xiàn)了樣品間無交叉污染，但仍需進行微通道洗滌。近年來，基于液滴微流體技術的液滴型微 PCR 芯片克服了這些不足。Wang等[34]首先報道了這種液滴型PCR芯片裝置，該裝置用注射泵驅(qū)動PCR反應液滴在95℃、72℃、55℃三個溫區(qū)間往復運動實現(xiàn)擴增。Bu等[35]采用數(shù)值模擬研究了芯片熱循環(huán)性能和壓電泵的驅(qū)動特性，結(jié)果表明基于液滴的微PCR芯片具有非常好的升降溫性能。Wang等[32]對液滴微流控PCR芯片的發(fā)展和優(yōu)缺點進行了總結(jié)，展示了一種納米級液滴微流控PCR芯片，研究了反應液濃度、在一溫區(qū)停留時間和模版量對液滴PCR的影響，提供了這種液滴微流控系統(tǒng)的詳細信息和在優(yōu)化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)了操作方面的參數(shù)。

3 微流控PCR芯片在法醫(yī)DNA檢驗中的應用及展望

3.1 DNA定量

DNA定量在法醫(yī)DNA檢驗中是必要的步驟，其主要目的確定要擴增的DNA的量。DNA混有抑制劑或高度降解或量太少都可導致PCR擴增失敗。因此，這就需要精確地測驗DNA模板的數(shù)量和質(zhì)量，定量必須只針對人類DNA且要靈敏[36]。在芯片上直接進行法醫(yī)DNA定量需要用實時PCR(real time PCR,RT-PCR)或定量PCR(quantitative PCR, qPCR)。

Horsman等[36]綜述了利用微流控PCR芯片進行DNA定量檢測的幾種方法，分別是Taqman熒光探針法（Northrup等，1998；Liu等，2002）、SYBR熒光染料法（Lin等，2002）和電化學方法（Lee等，2003）。他指出這些方法雖然對DNA定量是有效的，但都集成了加熱器和溫感器等，做成一次性適用的芯片成本比較大，而一次性適用在法醫(yī)檢驗中是很重要的。

2011年Yu[37]等展示了一種用于DNA定量的微流控裝置。采用外置的紅外線加熱方法和SYBR熒光染料，結(jié)合適當?shù)臑V鏡，把紅外線對熒光背景的影響降到最低，使整個熱循環(huán)過程中產(chǎn)生的熒光信號都被檢測到，成功對實現(xiàn)DNA的定量。這種裝置采用非接觸式紅外加熱，降低了芯片的制作成本，便于芯片的一次性適用，也有利與和PCR前的樣本提取、純化及PCR后的電泳檢測集成。

要利用微流控技術進行準確有效的DNA定量，還有許多工作要做，很多方法正處于發(fā)展階段，目前的微qPCR已經(jīng)可以滿足法醫(yī)DNA檢驗的需要，但在實際法醫(yī)DNA樣本分析中應用的報道還很少。傳統(tǒng)的qPCR方法可以同時進行男性/總DNA定量或基因組/線粒體DNA定量，這完全可以擴展到微流控裝置上進行[36]。

3.2 短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats，STR）復合擴增

在過去的20年中，STR分型已成為被普遍接受的進行個體識別的金標準[38]在微流控PCR芯片上進行STR位點的復合擴增已經(jīng)成為現(xiàn)實。Lagally等[39-40]和Waters等[41]完成了牙釉原蛋白基因（amelogenin）片段的擴增。Legendre等[42]用AmpFlSTR?、COfilerTM和ProfilerTM試劑盒在芯片上實現(xiàn)STR片段的擴增。Schmidt等[43]用PowerPlex16擴增試劑盒在芯片上實現(xiàn)1μl體系擴增。Legendre等[42]報道的STR位點復合擴增體系只有200nL，熱循環(huán)在100min內(nèi)完成。

傳統(tǒng)的整個DNA STR分析過程需要8-10小時，其主要原因是PCR過程耗時過長（大于3小時）[44]。在法醫(yī)實際中，往往需要對DNA進行現(xiàn)場快速分析，這也一直是法醫(yī)工作者們的共同追求目標。研究者們在這方面做了很多工作。Liu等[45]擴增9個STR位點用時45min。Hagan[46]等用紅外線加熱的方法，在45min內(nèi)擴增16個STR位點，得到這些位點的完整分型結(jié)果。

而在性侵害案件中，往往也需要做Y染色體的STR分型。Liu等[47]設計了種便攜式PCR-CE裝置，在1.5小時內(nèi)實現(xiàn)對釉原蛋白（amelogenin）基因座和3個Y-STR基因座（DYS390, DYS393, DYS439）的復合擴增及電泳分離。并對實際案件中的檢材（口腔試子和人骨骼）進行擴增，4個位點全部成功擴出。

上述報道的微流控PCR芯片技術的應用，都集成了樣品DNA的提取、純化或（和）電泳檢測功能，這使得樣品的處理更加自動化，減少了人為操作造成污染的可能。Bienvenue等[48]成功制作了集成樣本DNA的固相提取和PCR-STR位點復合擴增的芯片，實現(xiàn)對復雜生物樣本（全血和精斑）DNA的提取和擴增，但加熱和對PCR產(chǎn)物的電泳分析都是依賴傳統(tǒng)的方式。最近，Liu等[45]展示了種新的集成微流控系統(tǒng)，用探針進行序列特異性DNA純化后，在線注入PCR-CE微系統(tǒng)，在PCR后對反應腔進行清洗，并用這種系統(tǒng)對來自口腔試子樣本的DNA完成了快速STR分型。

目前，雖然在微流控PCR芯片上進行STR位點的復合擴增已經(jīng)得到很大的發(fā)展，但位點丟失的問題還沒有得到有效的解決，這需要進一步優(yōu)化用于這種芯片STR復合擴增的擴增試劑，達到甚至超過傳統(tǒng)的標準，可以用于不同種類的樣本（如各種液體、斑痕樣本，降解或（和）含有抑制劑的樣本，低拷貝數(shù)樣本等）。當完全發(fā)展起來時,微流控PCR技術無疑能很大程度地減少法醫(yī)DNA檢驗的時間和成本。

3.3 展望

在過去的十年多中，微流控PCR芯片技術快速發(fā)展。理想的PCR是在低體積的反應體系下實現(xiàn)快速有效的擴增。與傳統(tǒng)的PCR儀相比，微流控PCR芯片實現(xiàn)了低體積擴增，但隨后是否要降低反應體系中DNA的量還沒有進行充分的論證。每種PCR擴增方式都有自身的優(yōu)點和不足，要真正實現(xiàn)低成本、低體積、高速度和高效率可能還需要一定的時間。這些目標實現(xiàn)時，將會真正發(fā)揮出微流控PCR芯片的優(yōu)勢。

在法醫(yī)DNA檢驗分析中，微流控PCR芯片已開始嶄露頭角。法醫(yī)學家們可以根據(jù)實際的需要，設計制作單模（僅用于PCR擴增）的微裝置和全集成（集DNA提取、純化、擴增和分離檢測于一體）的微裝置。單模的更易實現(xiàn)高通量，在成批次地處理大量待檢DNA樣本方面有優(yōu)勢，而全集成的微裝置更適合現(xiàn)場分析和需要快速出結(jié)果的重要案件。目前已有用這些裝置在實際案件中進行快速現(xiàn)場分析中試用[45]，但還沒有大規(guī)模投入使用。隨著微流控技術的發(fā)展和應用，將改變現(xiàn)有的DNA檢驗方法，利用微流控分析技術進行現(xiàn)場快速、高效地處理案件。

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