孟 甜

（四川烹飪高等?？茖W(xué)校，四川 成都610100）

食品是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，其安全性直接關(guān)系到人類健康。微生物是影響食品安全最重要因素之一，食品中微生物種類、數(shù)量不僅決定食品貨架期，也是評(píng)價(jià)食品安全性的主要指標(biāo)[1]。食品法典委員會(huì)（CAC）將微生物性健康危害列為食源性危害的三大原因之一。特別是近年來(lái)，可導(dǎo)致人類感染的致病菌種類越來(lái)越多，病原微生物對(duì)人類的威脅越來(lái)越大[2]。如何快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)和評(píng)價(jià)食品中的微生物是全球研究的熱門(mén)問(wèn)題。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

1.1 瓊脂平板培養(yǎng)法

1881年，Robertkoch首次引入瓊脂平板培養(yǎng)法用以檢測(cè)微生物[3]。后來(lái)隨著食品對(duì)微生物的要求，該法逐漸用于快速檢測(cè)微生物。

1.1.1 選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)法

選擇性培養(yǎng)基是利用目的微生物對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)敏感程度的差異，在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制劑，用以抑制非目的微生物生長(zhǎng)，使目的微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

啤酒企業(yè)所處環(huán)境不同其污染菌群不同，檢測(cè)啤酒污染菌使用的培養(yǎng)基也不同。使用NPS培養(yǎng)基可以較為準(zhǔn)確的檢測(cè)出啤酒中厭氧有害微生物的數(shù)量(主要為乳酸菌)。若樣品污染較為嚴(yán)重，使用NBB-A培養(yǎng)基也可比較準(zhǔn)確的檢測(cè)出結(jié)果。這兩種培養(yǎng)基因加入了啤酒酵母抑制劑，生產(chǎn)用酵母不能在其上面生長(zhǎng)[4]。

1.1.2 顯色培養(yǎng)基檢測(cè)法

用顯色培養(yǎng)基快速鑒定微生物是一種相對(duì)較新的方法，該技術(shù)以生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物直接根據(jù)菌落顏色對(duì)菌種作出鑒定，常用于食源性致病菌檢測(cè)[5]。如李斯特菌是一類個(gè)體較小的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，其中只有單增李斯特菌和綿羊李斯特菌具有致病性。近年來(lái)，許多國(guó)家致力于李斯特菌顯色培養(yǎng)基的研究，針對(duì)李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶和β-D葡萄糖苷酶設(shè)計(jì)顯色底物可對(duì)李斯特菌進(jìn)行快速檢測(cè)。

但顯色培養(yǎng)基檢測(cè)法也有一定缺陷，如檢測(cè)混合感染微生物時(shí)，常會(huì)造成目標(biāo)菌漏檢和檢測(cè)結(jié)果假陰性；對(duì)檢測(cè)結(jié)果不能定量分析等。

1.2 顯微鏡鏡檢法

顯微鏡鏡檢法是較常規(guī)的檢測(cè)法，一般觀察微生物形態(tài)和定量檢測(cè)。主要步驟是：（1）樣品的處理：使用顯微鏡檢測(cè)樣品中的微生物濃度要高，因此對(duì)于一般樣品而言，要先富集后鏡檢。（2）鏡檢：在潔凈的載玻片上滴一滴準(zhǔn)備好的菌液，蓋上蓋玻片，再滴一滴香柏油，使用油鏡檢測(cè)。

2 現(xiàn)代檢測(cè)方法

由于傳統(tǒng)的快速檢測(cè)方法存在諸多問(wèn)題，為了能快速、方便、正確地檢驗(yàn)食品微生物，近年來(lái)許多國(guó)家對(duì)此進(jìn)行研究，并取得了進(jìn)展，與傳統(tǒng)方法相比現(xiàn)代檢測(cè)方法更快、更方便、更靈敏[6]。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法是英國(guó)生物化學(xué)家諾貝爾獎(jiǎng)金獲得者A.J.P.Martin等人1952年創(chuàng)立的一種新型分離分析方法。該法應(yīng)用于微生物檢測(cè)大約開(kāi)始于20世紀(jì)50年代末，1963年Able等首次通過(guò)細(xì)胞脂肪酸的分析來(lái)進(jìn)行細(xì)菌分類，幾乎時(shí)Oyama 等又提出用裂解氣相色譜法鑒定細(xì)菌[7]。

將微生物細(xì)胞經(jīng)過(guò)水解、甲醇分解提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學(xué)組分供氣相色譜儀進(jìn)行分析[8]。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數(shù)峰是共性的，只有少數(shù)峰具有特征性，可被用來(lái)進(jìn)行微生物鑒定，分析檢測(cè)常見(jiàn)細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

2.2.1 酶免疫檢測(cè)法

酶免疫檢測(cè)法（EIA）可根據(jù)抗原抗體反應(yīng)是否需要分離結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物分為均相和非均相兩種類型。非均相法較常用，包括液相免疫法與固相免疫法。固相免疫法的代表技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）[9]。

ELISA技術(shù)自20世紀(jì)70年代出現(xiàn)開(kāi)始就成為檢驗(yàn)中應(yīng)用最為廣泛的方法之一。它是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后，通過(guò)定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。

ELISA技術(shù)具有可定量、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、標(biāo)記物穩(wěn)定、用范圍寬、結(jié)果判斷客觀、簡(jiǎn)便完全、檢測(cè)速度快以及費(fèi)用低等特點(diǎn)，且同時(shí)可進(jìn)行上千份樣品的分析。

2.2.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析（IC）是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來(lái)的快速免疫分析技術(shù)，它將免疫學(xué)原理和層析原理結(jié)合，借助毛細(xì)管作用，樣品在條狀纖維制成的膜上泳動(dòng)，其中的待測(cè)物與膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過(guò)酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物，在短時(shí)間（20min內(nèi)）便可得到直觀結(jié)果。利用免疫層析原理開(kāi)發(fā)出的各種食品微生物檢測(cè)試紙條具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

2.2.3 免疫磁珠分離法

免疫磁珠分離法（IMS）是將磁性微球與免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)的方法。該方法是先用抗體包被的磁珠與樣品混合，再用一個(gè)磁場(chǎng)裝置收集磁珠。

該方法可快速的從食品成分中分離出靶細(xì)菌，克服了選擇性培養(yǎng)基的抑制作用問(wèn)題。有報(bào)道稱用免疫磁性分離技術(shù)從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門(mén)氏菌。

2.2.4 免疫熒光法

免疫熒光法（IFT）是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

免疫熒光法主要有直接法和間接法。目前免疫熒光技術(shù)可用于沙門(mén)氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等的快速檢測(cè)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)有特異性強(qiáng)、敏感性高速度快。

2.2.5 乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）是用人工大分子乳膠顆粒標(biāo)記抗體，使之與待測(cè)抗原發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)，以達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)病原微生物或毒素的目的。如用于檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的Aureus Tes試劑盒，該試劑的聚苯乙烯乳膠粒子中含有抗金黃色葡萄球菌A蛋白的IgG，當(dāng)含有金黃色葡萄球菌的樣品懸浮液加入含乳膠粒子的試劑后，A蛋白與IgG結(jié)合，凝聚酶和鞭毛抗原結(jié)合，lmin內(nèi)將產(chǎn)生凝聚反應(yīng)。

2.2.6 酶聯(lián)熒光免疫法

酶聯(lián)熒光免疫法（ELFIA）是在酶聯(lián)免疫吸附分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)方法。將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來(lái)，在普通酶免疫分析的基礎(chǔ)上用理想的熒光底物代替生色底物，可提高分析的靈敏度和增寬測(cè)量范圍，減少試劑的用量。

目前，將酶放大技術(shù)、固相分離及熒光檢測(cè)三者聯(lián)合將會(huì)成為熒光免疫分析中最靈敏的方法。

2.2.7 免疫印跡法

免疫印跡（immunoblotting）法分三個(gè)步驟：第一，聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二，電轉(zhuǎn)移，將凝膠中己分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第三，酶免疫定位，將前兩步中已分離，但肉眼不能見(jiàn)到的抗原帶顯示出來(lái)。

免疫印跡法綜合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特異性，是一種有效的分析手段廣泛應(yīng)用于酵母和真菌的檢測(cè)中。

2.3 傳感器檢測(cè)法

2.3.1 基因傳感器

基因傳感器是把已知核苷酸序列的半單鏈DNA分子固定在傳感器上（也稱ssDNA探針）和另一條互補(bǔ)ssDNA（目標(biāo)DNA）雜交，形成雙鏈DNA（dsDNA）后表現(xiàn)出一定的物理信號(hào)，再通過(guò)換能器反映出來(lái)。基因傳感器使對(duì)目的DNA測(cè)量時(shí)間大大縮短，且操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。

目前，基因傳感器主要有石英晶體振蕩器、光學(xué)式DNA傳感器等。Uramatsu等采用抗體壓電晶體生物傳感器測(cè)定大腸桿菌，檢測(cè)細(xì)菌下限為105個(gè)/mL。

2.3.2 生物傳感器

生物傳感器基本原理是通過(guò)被測(cè)分子與固定在生物接受器上的敏感材料發(fā)生特異性結(jié)合，并發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熱焓、離子強(qiáng)度、pH、顏色或質(zhì)量等變化信號(hào)，且反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)弱在一定條件下與特異性結(jié)合的被測(cè)分子含量存在一定數(shù)學(xué)關(guān)系，這些信號(hào)經(jīng)換能器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)后被放大測(cè)定，從而間接測(cè)定被測(cè)分子的量[10]。它的特點(diǎn)是高特異性和高靈敏度。

有試驗(yàn)已成功表明，采用光纖傳感器與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生物放大作用耦合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中李斯特菌單細(xì)胞基因的檢測(cè)，而采用酶免疫電流型生物傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)存在于食品中少量的沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等的檢測(cè)。

2.4 分子生物學(xué)檢測(cè)法

2.4.1 PCR技術(shù)

PCR是l985年由美國(guó)Kary Mullis等人首創(chuàng)并由美國(guó)Cetus公司開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA的方法[11]。利用PCR檢測(cè)細(xì)菌，以快速、靈敏的檢測(cè)樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，尤其是那些人工無(wú)法培養(yǎng)的細(xì)菌。

該方法已經(jīng)對(duì)乳酸菌、雙歧桿菌等進(jìn)行了精確的檢測(cè)和鑒定。用于檢測(cè)啤酒中淀粉酵母和啤酒酵母、水體中大腸桿菌和大腸菌群。另外，肉毒梭菌、沙門(mén)氏菌、變形弧菌、大腸桿等病菌都有用PCR方法檢測(cè)的報(bào)道。但是PCR技術(shù)的使用也有局限性，僅限于那些核酸序列已知的微生物的鑒定。

2.4.2 基因芯片

將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上的寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過(guò)掃描儀定量和分析熒光分布模式來(lái)確定檢測(cè)樣品是否存在某些特定微生物。

Appelbaum在對(duì)幾種細(xì)菌進(jìn)行鑒別時(shí)，設(shè)計(jì)了一種鑒別診斷芯片，一方面從高度保守基因序列出發(fā)，即以各菌種間的差異序列為靶基因，另一方面選擇同種細(xì)菌不同血清型所特有的標(biāo)志基因?yàn)榘谢?，固著于芯片表面，同時(shí)還含有細(xì)菌所共有的l6SrDNA保守序列以確定為細(xì)菌感染標(biāo)志，不僅敏感度高于傳統(tǒng)方法，且操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

2.5 自動(dòng)檢測(cè)法

美國(guó)麥道保健系統(tǒng)公司制造了稱作Vitek AMS的微生物自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，該裝置最大特點(diǎn)在于無(wú)須經(jīng)過(guò)微生物分離培養(yǎng)和純化的過(guò)程，能直接從樣品中檢出特殊的微生物種類和菌群。麥道公司在原有Viteck AMS的基礎(chǔ)上，又推出第二代檢測(cè)系統(tǒng)，即Viteck免疫診斷檢測(cè)系統(tǒng)(ⅥDAS)。它是集固相吸附，酶聯(lián)免疫，熒光檢測(cè)和乳膠凝集試驗(yàn)諸方法優(yōu)點(diǎn)于一體的綜合性檢測(cè)系統(tǒng)[12]。

2.6 抗阻測(cè)定法

在含有幾種不同底物的培養(yǎng)基上，分別接種適量的被檢微生物，經(jīng)培養(yǎng)后可用阻抗測(cè)量?jī)x在檢測(cè)其生長(zhǎng)情況的同時(shí)也表達(dá)出特征進(jìn)而鑒別其種、屬。此法廣泛用于細(xì)菌、酵母菌、霉菌和支原體等的檢測(cè)和鑒定，具有高敏感性、特異性、快反應(yīng)性和高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。

2.7 “即用膠”測(cè)定法

“即用膠”測(cè)定法是把lml食物樣品傾入一盛有無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后再將混合物倒入一個(gè)裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中?；旌衔锱c膠質(zhì)接觸后便形成瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后便可計(jì)數(shù)菌種及數(shù)量。該系統(tǒng)是包裝好的產(chǎn)品，用時(shí)不需滅菌，極適合野外測(cè)定。

2.8 自動(dòng)旋轉(zhuǎn)平板測(cè)數(shù)法

通過(guò)螺旋制板機(jī)將0.035mL液態(tài)樣品以阿基米德螺線的形式接種在瓊脂平板上，輸樣量隨著輸液管從平板中心向邊緣的移動(dòng)而減少。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，將平板放在計(jì)數(shù)格上，此格劃分成一些已知面積的區(qū)間，菌落數(shù)即在此區(qū)間內(nèi)計(jì)數(shù)。此法已被AOAC推薦為法定方法，在美國(guó)廣泛采用[13]。

3 小結(jié)

隨著新型設(shè)備的使用如毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法[14]，新型設(shè)備的聯(lián)用，如氣相色譜-原子吸收聯(lián)用，及新型方法的聯(lián)用如RT-PCR技術(shù)，不但能夠檢測(cè)到活性較強(qiáng)的細(xì)菌，而且還能夠檢測(cè)到處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌，具有較強(qiáng)區(qū)分死活菌的能力，檢測(cè)結(jié)果可作為菌體活性評(píng)估的重要參照，這是其它快速檢測(cè)法以及傳統(tǒng)檢測(cè)法均無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)[15]，將來(lái)的食品微生物檢測(cè)將更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便。

食品安全問(wèn)題一直是引起人們廣泛關(guān)注的全球性問(wèn)題之一，長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家們都在尋求簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的快速檢測(cè)方法，從傳統(tǒng)煩瑣費(fèi)時(shí)的瓊脂平板培養(yǎng)法到現(xiàn)代方便、靈敏的各種免疫法、分子生物學(xué)及儀器聯(lián)用等方法，雖然有些技術(shù)方法還存在不完善、不足的地方，但是各國(guó)的專家都在致力于改善或?qū)で蟾涌茖W(xué)、更加完善的快速檢測(cè)技術(shù)[16]，相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步有更多新的技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)。不久將來(lái)食品微生物檢測(cè)技術(shù)一定能更好的服務(wù)于人類！

[1] 蘇鳳賢，張寶善，曹穩(wěn).食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(2)：78~81.

[2] 趙冬云.快速檢測(cè)食品中微生物方法的進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，16(6)：2126~2127.

[3] 夏晴.微生物的快速檢測(cè).日用化學(xué)品科學(xué)，1999，S1.

[4] 康虹.啤酒釀造中微生物快速檢測(cè)法的應(yīng)用[J].啤酒科技，2003(10)：48-49.

[5] 張淑紅，吳清平，張菊梅，等.顯色培養(yǎng)基在幾種食源性致病菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(6)：108~111.

[6] 李振權(quán).淺談食品微生物的檢測(cè)方法[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007(10)：180~181.

[7] 張勇兵.氣相色譜法在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，1(2)：291~292.

[8] 唐春林，車振明.食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品工程，2006，1(3)：52~55.

[9] 佟平，陳紅兵.免疫學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].江西食品工藝，2007（1）：36-38.

[10] 項(xiàng)錦欣，王勇德.生物傳感器在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].肉類工業(yè)，2004(8)：46-48.

[11] 陳忠杰，寧豫昌，高領(lǐng).食品微生物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2007，2(5)：22-24.

[12] 杜小琴，車振明.分子技術(shù)快速檢測(cè)食品有害微生物[J].食品工程，2006，4(12)：5~7.

[13] 龍夫.食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)動(dòng)向[J].食品安全，2004，6：55-56.

[14] 繆佳錚，張虹.儀器分析方法在食品微生物快速檢測(cè)方面的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(3)：166-169.

[15] 張沖，劉祥，陳計(jì)巒.食品中微生物檢測(cè)新技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(12)：212-216.

[16] Kramer M F，Tmas TB，DeMarco DR et a1.Journal of rapid methods and automa tion in microbiology，2002，10(2)：93.