楊青青

（北京教育學(xué)院，北京 100044）

引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Potymerase Chain Reaetion,PCR)技術(shù)自1985年問世以來，以其操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)迅速進(jìn)入生命科學(xué)研究、臨床疾病診斷、法醫(yī)鑒定、考古學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品研究、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，從某種意義上可以說二十一世紀(jì)是"分子生物學(xué)世紀(jì)"。作為高校經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)的PCR技術(shù)已經(jīng)悄悄的進(jìn)入中學(xué)生物的課本中并且占有一席之地。對(duì)于中學(xué)生，PCR實(shí)驗(yàn)的難度無疑很大，一線教師往往會(huì)覺得PCR實(shí)驗(yàn)涉及的理論知識(shí)背景繁雜，操作過程多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，主要巴克擴(kuò)增片段的特異性不強(qiáng)以及產(chǎn)物產(chǎn)量低等問題。本文正是針對(duì)以上問題，立足于為改善PCR實(shí)驗(yàn)效果提供幾點(diǎn)個(gè)人思考。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性——退火——延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

① 模板DNA的變性：

模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配 對(duì)結(jié)合；

③ 引物的延伸：

DNA模板——引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的"半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

2 PCR實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)介紹

2.1 引物設(shè)計(jì)的注意事項(xiàng)

引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長(zhǎng)或過短均會(huì)使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3’末端與模板DNA一定要配對(duì)，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計(jì)時(shí)可在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會(huì)增加引物二聚或錯(cuò)配的幾率?，F(xiàn)在引物設(shè)計(jì)越來越多的借助于相關(guān)的專業(yè)設(shè)計(jì)軟件，更快更準(zhǔn)確的設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)人員所需要的引物。

2.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 高保真DNA聚合酶的選擇

Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但無3’-5’外切酶活性，因此對(duì)單核苷酸的錯(cuò)配無校正功能，發(fā)生堿基錯(cuò)配的幾率為 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯(cuò)配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯(cuò)誤率)。

2.2.2 鹽離子濃度控制

Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對(duì)Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴(kuò)增。

2.2.3 dNTP濃度的控制

dNTP的濃度過高會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯(cuò)配誤差和提高使用效率。

2.3 Tm值的合理選擇

溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長(zhǎng)度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。

2.4 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果污染的防治

減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽性和陰性對(duì)照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲(chǔ)存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的檢測(cè)

一般為48 h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。每次實(shí)驗(yàn)，都要認(rèn)真設(shè)計(jì)好對(duì)照試驗(yàn)，包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個(gè)重要手段，擴(kuò)增片段的檢測(cè)和分析才是目的，根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小；點(diǎn)雜交技術(shù)除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測(cè)的特異性與敏感性；電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法(PCRELISA、PCR-EIA、PCR-OLA等)均有助于PCR產(chǎn)物的精確分析。在對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)的時(shí)候往往會(huì)用到核酸特異染料，常見的是EB（溴化乙錠）。該染料靈敏度較高，是應(yīng)用最廣的核酸染料，但同時(shí)存在安全隱患，因其插入核酸能導(dǎo)致其變異，所以在實(shí)驗(yàn)過程中一定要注意佩戴好手套及相應(yīng)的防護(hù)措施，這一點(diǎn)在開展學(xué)生實(shí)驗(yàn)時(shí)尤為重要。

4 常見問題討論

變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶?？赡苡捎谝锱c靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體，也可能是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。所以必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物，減低酶量或調(diào)換另一來源的酶，降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起的。

5 中學(xué)PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)

PCR實(shí)驗(yàn)室的建立，是生物課開設(shè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的必備條件，是依據(jù)學(xué)生的興趣和需要,在教師的指導(dǎo)下有目的、有計(jì)劃、有組織地通過多項(xiàng)活動(dòng)項(xiàng)目和活動(dòng)方式使學(xué)生獲得直接經(jīng)驗(yàn)和最新信息以及實(shí)踐能力的基礎(chǔ)。它對(duì)提高學(xué)生素質(zhì),促進(jìn)學(xué)生個(gè)性的充分發(fā)展,提高各種能力,具有獨(dú)特的功能,對(duì)素質(zhì)教育的貫徹和落實(shí)有極大的帶頭和示范作用。

（1）加深學(xué)生對(duì)課本知識(shí)的理解。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課能增加學(xué)生動(dòng)手的機(jī)會(huì),使學(xué)生在動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)的過程中更加深刻地理解理論知識(shí),通過簡(jiǎn)單易懂的實(shí)驗(yàn)來加深學(xué)生對(duì)抽象理論的理解,使原來枯燥乏味的分子生物學(xué)變得生動(dòng)有趣,學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣也明顯增加。同時(shí)掌握基本的分子生物學(xué)技術(shù),適應(yīng)未來社會(huì)發(fā)展對(duì)人才的需求。

（2）提高學(xué)生的積極性和主動(dòng)性，有利于培養(yǎng)學(xué)生的興趣、愛好、特長(zhǎng),更利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)造力。由于生物技術(shù)的內(nèi)容豐富,形式多樣,比較符合中學(xué)生的特點(diǎn)。強(qiáng)烈的好奇心和旺盛的求知欲又是推動(dòng)人進(jìn)行創(chuàng)造思維的內(nèi)部動(dòng)力,是創(chuàng)造能力培養(yǎng)的前提和關(guān)鍵。例如“親子鑒定實(shí)驗(yàn)”、“染色體分型實(shí)驗(yàn)”，可以引發(fā)學(xué)生獨(dú)立思考、探究實(shí)踐的真諦。

（3）能夠開闊學(xué)生視野,提高素質(zhì)教育,充分發(fā)展學(xué)生綜合能力。在實(shí)驗(yàn)中讓學(xué)生去參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、親自動(dòng)手，獲得直接經(jīng)驗(yàn)。使學(xué)生加深理解和鞏固課堂上所學(xué)知識(shí)，提高多種能力，接受科學(xué)方法、科學(xué)思維的訓(xùn)練。讓學(xué)生從小養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，發(fā)展創(chuàng)造思維，形成創(chuàng)造品格，增長(zhǎng)創(chuàng)造才干。如組織學(xué)生檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)本，再如針對(duì)不同樣本的DNA提取和分離“實(shí)驗(yàn)步驟多、難度大”的特點(diǎn)，可以組織學(xué)生從不同角度設(shè)計(jì)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)……。通過各種活動(dòng)的訓(xùn)練，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)的能力，也培養(yǎng)了他們勇于戰(zhàn)勝困難的科學(xué)精神。

（4）利于培養(yǎng)學(xué)生主體意識(shí)和自我教育能力。實(shí)驗(yàn)中學(xué)生始終處于主體地位：學(xué)生主動(dòng)參與實(shí)驗(yàn)課題提出、方案設(shè)計(jì)、實(shí)施操作，總結(jié)、討論、撰寫論文等全部過程。學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)、掌握、運(yùn)用知識(shí)，真正成為學(xué)習(xí)的主體；在活動(dòng)中最大限度地發(fā)揮學(xué)生主觀能動(dòng)作用，進(jìn)行自我組織和評(píng)價(jià),培養(yǎng)自己實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度、不斷探求新知的精神。

（5）提高生物教學(xué)的總體水平、突出生物教學(xué)的重要性。多年來由于受應(yīng)試教育的影響，學(xué)校不重視生物課實(shí)驗(yàn)，學(xué)生不愿意學(xué)，教師有情緒，高等師范學(xué)校生物專業(yè)受冷落，是造成生物教學(xué)薄弱的根本原因。因此，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的開設(shè)，能夠提高教師的綜合素質(zhì)，激發(fā)教師的積極性，提高了教學(xué)水平。

6 展望

PCR是分子生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)，又是常規(guī)技術(shù)。它的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展，即被迅速推廣并應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。本文核心在于解決中學(xué)階段PCR實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中遇到的幾類棘手問題，目的在于通過總結(jié)PCR實(shí)驗(yàn)的成功核心要素，便于教師和學(xué)生在今后的實(shí)驗(yàn)過程中能將該實(shí)驗(yàn)的教學(xué)效果加以改善，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生探究能力和分析解決問題的能力，更重要是搭建中學(xué)實(shí)驗(yàn)與高等學(xué)府科研的橋梁，讓學(xué)生在以后的研究道路中走得更穩(wěn)更實(shí)。