王 霞 ，馬燕斌 ，吳 霞 ，梁愛華 ，馬冬菊 ，王 華 ，李燕娥

（1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；3.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

草甘膦是一種廣譜性滅殺除草劑。由于其具有在土壤中極易降解和對環(huán)境幾乎不造成為害等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到大面積推廣使用[1]。但是在農(nóng)田中使用草甘膦滅殺雜草的同時，往往也會對作物造成損害。

為此，研究培育具有抗或耐草甘膦除草劑的作物新品種成為育種的重點(diǎn)目標(biāo)。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，其中，國內(nèi)以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所為代表的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的成功研制，極大地促進(jìn)了我國棉花的生產(chǎn)發(fā)展，也為以后我國新的轉(zhuǎn)基因棉花選育改良等研究奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)[2-4]。

結(jié)合現(xiàn)階段棉花生產(chǎn)的實(shí)際發(fā)展需求，筆者對我國在抗草甘膦除草劑棉花的研究應(yīng)用等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了概括探討。

1 草甘膦除草劑與棉花的抗草甘膦對策

植物能夠通過莖葉吸收草甘膦，而草甘膦是通過抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS酶）的活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，從而殺滅雜草。由于草甘膦對所有植物的該代謝途徑作用效果相同，所以，在草甘膦殺滅雜草時，對所有植物的作用機(jī)理相同。因此，除草劑的使用實(shí)現(xiàn)了對作物田內(nèi)雜草的免除，同時也可降低勞動力的使用及提高生產(chǎn)效率，但由于作物本身對草甘膦不具有耐藥性，因而，草甘膦的使用也會對作物產(chǎn)生藥害。

針對這一狀況和潛在的商業(yè)利益，各國科研工作者開始進(jìn)行抗草甘膦育種的研究。我國科研人員也進(jìn)行了積極的研究來防止其為害發(fā)生，并取得了一定的成果。解決方法除了通過在田間噴灑除草劑進(jìn)行預(yù)防外，通過常規(guī)育種選育和基因工程等手段來獲得抗除草劑的棉花等作物，也是解決這一問題的有效途徑。具體的方法原理包括幾點(diǎn)。

一是通過不同草甘膦濃度水平脅迫的方法選擇育種。這一手段的目的是在一定濃度的草甘膦抑制前提下，植物體內(nèi)仍有足夠的EPSPS酶進(jìn)行正常代謝，最終使選育出的作物耐草甘膦性提高。二是通過分子技術(shù)手段。其包括過量表達(dá)作物自身的EPSPS酶、對EPSPS酶本身進(jìn)行突變修飾以及對EPSPS酶的代謝途徑進(jìn)行修飾，使作物的EPSPS酶降低或不受草甘膦抑制而保持正常的代謝。三是利用某些微生物的EPSPS酶。該方法與第2種方法類似，但由于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，蛋白序列差異較大，因此，篩選到不受草甘膦抑制或受抑制作用較小的EPSPS酶的可能性較大。四是尋找能夠分解代謝草甘膦的基因，將這一類基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物后在細(xì)胞內(nèi)形成一類防護(hù)機(jī)制，從而保護(hù)目標(biāo)植物不受草甘膦藥害。五是通過物理或化學(xué)等手段處理（包括體細(xì)胞誘變、輻照和化學(xué)誘變劑等）作物后獲得抗性基因突變體植株。這一方法操作簡單，篩選的基因型突變有可能更加廣泛，但能夠獲得抗性植株的概率較小，且基因型突變鑒定的后期工作量較大。

2 抗草甘膦基因來源及相關(guān)分子生物學(xué)研究

研究表明，EPSPS酶和GAT基因編碼的草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)Σ莞熟⒖剐云鸬揭欢ㄗ饔?，其中，對EPSPS酶的研究較多，應(yīng)用也較為廣泛，而草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶及其GAT編碼基因的研究相對較少。目前，通過生物工程手段利用的主要是抗草甘膦EPSPS合成酶，根據(jù)基因序列比對和抗體試驗(yàn)結(jié)果，該基因可分為EPSPSⅠ和EPSPSⅡ。這2類EPSPS基因的序列同源性僅為50%左右，抗體作用不發(fā)生交叉反應(yīng)，且這2類編碼基因來源廣泛，包括各類植物和微生物。

劉柱等[5]從極端污染的土壤中分離到1株對草甘膦有極端抗性的細(xì)菌菌株HTG7。它能夠在以草甘膦為選擇壓力的限制性培養(yǎng)基上生長，其最高耐受能力為500mmol/L。劉光全等[6]通過PCR突變技術(shù)獲得了具有EPSPS酶功能而不具有草甘膦抗性的Pmu1和Pmu2突變株，并通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬和測序手段預(yù)測其突變位點(diǎn)對草甘膦抗性的重要性。

除通過對微生物的抗草甘膦特性進(jìn)行篩選獲得EPSPS基因外，在植物的EPSPS基因研究方面，尉萬聰?shù)萚7]通過草甘膦處理誘導(dǎo)大豆和棉花的表達(dá)，克隆了相關(guān)的63個有差異的EST序列。程海剛等[8]對青麻EPSPS基因在酵母中表達(dá)認(rèn)為，該基因具有生物學(xué)功能。周曉卉等[9]進(jìn)行了薤白EPSPS合成酶基因cDNA的克隆與原核表達(dá)分析，認(rèn)為薤白EPSPS對草甘膦具有一定的抗性。鄧運(yùn)濤等[10]對諸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列進(jìn)行了分析。童旭宏等[11]克隆獲得了陸地棉的1個拷貝EPSPS基因，該基因編碼序列長度為1 566 bp，其組織特異性表達(dá)具有一定的差異。

3 棉花及其他作物中EPSPS酶的研究

我國在抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花等方面進(jìn)行了較多研究。祝水金等[12]利用體細(xì)胞連續(xù)定向篩選技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞誘變技術(shù)獲得了非轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花突變體株。陳旭升等[13]利用草甘膦篩選到1個抗草甘膦棉花種質(zhì)系G-6，通過抗性遺傳規(guī)律分析，認(rèn)為抗性符合3∶1的分離規(guī)律，抗性受1對顯性基因控制。謝龍旭等[14]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把抗草甘膦基因aroAM12導(dǎo)入棉花中，并對其抗性進(jìn)行了研究。劉錫娟等[15]把熒光假單胞菌種克隆的EPSPS基因轉(zhuǎn)入煙草和棉花中獲得抗草甘膦植株。趙福永等[16]成功地將抗草甘膦基因aroA-M1導(dǎo)入棉花中。此外，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所與浙江大學(xué)等國內(nèi)單位合作，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法培育新型的抗草甘膦與抗蟲棉花也已經(jīng)取得巨大進(jìn)展。

同時，在玉米、水稻、大豆等作物中也有較多的研究報道。王秀君等[17]利用花粉管通道法把mG2-EPSPS基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，并獲得能耐受0.25%草甘膦藥液的抗性植株。蘇軍等[18]利用Error-prone PCR獲得的EPSPS酶突變基因轉(zhuǎn)入水稻中，并進(jìn)行了較詳細(xì)的抗性和農(nóng)藝性狀的調(diào)查研究。王曉波等[19]對外源抗草甘膦EPSPS基因在大豆基因組中的整合與定位進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)中NOS下游的大豆基因組序列發(fā)生重排，導(dǎo)致一個編碼HEC1和HEAT的功能域基因結(jié)構(gòu)受到影響。除此之外，鄧力華等[20]利用EPSPS基因作為選擇性篩選標(biāo)記構(gòu)建了抗蟲表達(dá)載體，為其后續(xù)的轉(zhuǎn)基因作物篩選利用提供了多樣化。另外，卜貴軍等[21]研究了對大豆噴施草甘膦后，草甘膦對大豆葉片超微結(jié)構(gòu)及生化指標(biāo)的影響。劉延等[22]對草甘膦噴施田旋花和打碗花后體內(nèi)草莽酸含量進(jìn)行了初步分析。

4 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性研究

目前，轉(zhuǎn)基因?qū)ι锇踩缘挠绊懕妒荜P(guān)注，但相關(guān)研究的結(jié)論性結(jié)果較少。其中，徐廣惠等[23]認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因大豆在不同程度上降低了根際土壤細(xì)菌的數(shù)量和細(xì)菌群落的多樣性，并對根際土壤中Nitrospira屬細(xì)菌有一定的抑制作用。但抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對節(jié)肢動物群落多樣性無明顯影響[24]。而用含轉(zhuǎn)基因豆粕的飼料飼喂大鼠時，在胃、腸道內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因豆粕的內(nèi)源基因和外源基因片段，但在其血液及各組織器官中則沒有發(fā)現(xiàn)[25]。另外，自然條件下人為加大蟲媒傳播（大于10頭/m2），抗草甘膦基因的花粉漂移概率接近0.05%，漂移距離為0.7 m[26]。此外，宋小玲等[27]以抗除草劑草甘膦和草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜為父本、諸葛菜為母本，在人工授粉條件下研究抗性基因向諸葛菜的潛在基因漂移，認(rèn)為抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向諸葛菜漂移的可能性較小。

目前，關(guān)于植物轉(zhuǎn)基因的安全性評價問題存在諸多爭論。國內(nèi)已有對轉(zhuǎn)基因安全性的研究，但均屬初步探討，試驗(yàn)結(jié)果仍待探究。而毋庸置疑的是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段對植物基因功能的研究具有極大幫助。在作物基因利用方面，我國棉花抗蟲性的成功對于棉花生產(chǎn)具有巨大促進(jìn)作用，但轉(zhuǎn)基因作物安全性仍將面臨諸多爭論與挑戰(zhàn)。

5 抗草甘膦基因?qū)＠c轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化競爭

我國是草甘膦使用較多的國家，在與草甘膦相關(guān)抗性基因的研究方面雖然取得一定的進(jìn)展，但與國外相比差距仍然較大。宋敏等[28]對抗草甘膦基因EPSPS的專利保護(hù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，EPSPS的專利申請量迅速增加，且絕大部分專利由孟山都等跨國公司擁有；而我國目前申請的EPSPS基因?qū)＠鄬^少。在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花等作物的商業(yè)化方面，棉花、玉米、大豆、甜菜、馬鈴薯等多種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在美國、阿根廷、加拿大、巴西等國被批準(zhǔn)種植，中國也已批準(zhǔn)棉花、玉米、大豆、油菜的種植，但目前并沒有看到國內(nèi)科研機(jī)構(gòu)或公司等在上述作物育種審定方面的報道。另外，相比國外公司或單位所申請的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物種類種植許可可以看出，我國對抗草甘膦基因及其轉(zhuǎn)基因棉花等作物研究起步相對較遲，但近年來研究非?；钴S，這與生產(chǎn)實(shí)際需要以及潛在的商業(yè)價值密切相關(guān)；無論如何，抗草甘膦或其他轉(zhuǎn)基因作物的研究已經(jīng)成為目前作物遺傳育種中重要的組成部分。

6 結(jié)語

到目前為止，世界上商業(yè)化的抗草甘膦棉花等作物的種植面積和種類在不斷增加。基于轉(zhuǎn)基因作物培育的競爭趨勢，認(rèn)為當(dāng)前應(yīng)積極篩選新的有利用價值的抗草甘膦基因，并詳細(xì)闡明基因功能以及對其進(jìn)行知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和開發(fā)利用，對我國培育具有競爭優(yōu)勢的棉花等作物品種將會具有明顯的推動作用。目前，我國通過轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)投入，極大地推動了我國在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的競爭發(fā)展，而轉(zhuǎn)基因作物的研究發(fā)展將會更加廣泛。鑒于此種發(fā)展趨勢，科學(xué)地改進(jìn)目前轉(zhuǎn)基因的方法、嚴(yán)格界定轉(zhuǎn)基因作物利用目的和種類、積極培養(yǎng)高素質(zhì)科研人員以及規(guī)范轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)等對轉(zhuǎn)基因安全性都能夠起到一定的積極作用。此外，棉花生產(chǎn)在滿足我國不同消費(fèi)需求方面將會發(fā)揮重要作用，而安全利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對促進(jìn)我國棉花等作物的生產(chǎn)具有重要意義。

[1]蘇少泉.草甘膦述評[J].農(nóng)藥，2005，44（4）：145-149.

[2]范巧蘭，陳耕，李永山，等.轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同生育期對土壤微生物的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（12）：34-36.

[3]上官小霞，吳霞，李燕娥.棉花GhRDL1基因啟動子分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（1）：6-10.

[4]張林水，吳霞，杜春芳，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉晉棉44號選育研究及高產(chǎn)栽培要點(diǎn)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（6）：49-52.

[5]劉柱，陳明，徐玉泉，等.一株草甘膦極端抗性菌株的分離和分子鑒定[J].高技術(shù)通訊，2002（12）：25-28.

[6]劉光全，劉柱，陸偉，等.草甘膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 [J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006，22（3）：197-203.

[7]尉萬聰，張銳，郭三堆.草甘膦誘導(dǎo)表達(dá)的大豆與棉花EST序列的分離[J].中國生物工程雜志，2005，25（7）：80-85.

[8]程海剛，張銳，羅淑萍，等.青麻epsps基因在酵母中表達(dá)[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，30（4）：52-56.

[9]周曉卉，黃麗華，蔣向，等.薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆與原核表達(dá)分析 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（7）：2297-2304.

[10]鄧運(yùn)濤，吳俊，茍曉松，等.諸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析[J].四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2003，40（3）：570-573.

[11]童旭宏，吳玉香，祝水金.陸地棉EPSPS基因的克隆及其組織特異性表達(dá)分析[J].棉花學(xué)報，2009，21（4）：259-64.

[12]祝水金，汪靜兒，俞志華，等.棉花抗草甘膦突變體篩選及其在雜種優(yōu)勢利用中的應(yīng)用 [J].棉花學(xué)報，2003，15（4）：227-230.

[13]陳旭升，劉新民，狄佳春，等.陸地棉抗草甘膦性狀的遺傳規(guī)律分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：76-77.

[14]謝龍旭，李云鋒，徐培林.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性 [J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2004，30（2）：173-178.

[15]劉錫娟，劉昱輝，王志興，等.轉(zhuǎn)5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因抗草甘膦煙草和棉花的獲得[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（6）：958-963.

[16]趙福永，謝龍旭，田穎川，等.抗草甘膦基因aroAM12及抗蟲基因Bts1m的轉(zhuǎn)基因棉株 [J].作物學(xué)報，2005，31（1）：108-113.

[17]王秀君，郎志宏，陸偉，等.利用花粉管通道法將耐草甘膦基因mG2-epsps導(dǎo)入玉米自交系的研究初報[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2008，10（4）：56-62.

[18]蘇軍，陳建民，田大剛，等.Error-prone PCR獲得EPSP酶突變基因提高水稻的草甘膦抗性 [J].分子植物育種，2008，6（5）：830-836.

[19]王曉波，蔣凌雪，魏利，等.外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因組中的整合與定位 [J].作物學(xué)報，2010，36（3）：365-375.

[20]鄧力華，于元杰，李寶健，等.Epsps基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的多基因抗蟲表達(dá)載體構(gòu)建[J].生物技術(shù)，2008，18（1）：9-13.

[21]卜貴軍，鄭小江，王學(xué)東，等.草甘膦對大豆葉片超微結(jié)構(gòu)及生化指標(biāo)的影響 [J].中國油料作物學(xué)報，2010，32（2）：285-289.

[22]劉延，張朝賢，黃紅娟，等.草甘膦對田旋花和打碗花體內(nèi)莽草酸含量的影響[J].雜草科學(xué)，2008（2）：10-11.

[23]徐廣惠，王宏燕，劉佳.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）對根際土壤細(xì)菌數(shù)量和多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報，2009，29（8）：4535-4540.

[24]吳奇，彭煥，彭可維，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對豆田主要害蟲發(fā)生動態(tài)的影響[J].植物保護(hù)，2007，33（5）：50-53.

[25]趙志輝，楊立桃，艾曉杰，等.轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆對大鼠生理代謝的影響及外源基因水平轉(zhuǎn)移研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，29（1）：77-80.

[26]呂曉波，王宏燕，劉琦，等.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）在黑土生態(tài)系統(tǒng)種植的安全性研究 [J].大豆科學(xué)，2009，28（2）：260-265.

[27]宋小玲，強(qiáng)勝.抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜向雜草諸葛菜的潛在基因漂移[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31（4）：526-529.

[28]宋敏，劉麗軍，蘇穎異，等.抗草甘膦EPSPS基因的專利保護(hù)分析[J].中國生物工程雜志，2010，30（2）：147-152.