趙逸松 宋學(xué)英 薛 冰

(首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京 100069)

質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)［1］。對(duì)于表征有機(jī)化合物而言，第一步和最重要的步驟就是快速準(zhǔn)確地確定相對(duì)分子質(zhì)量，電噴霧電離四極桿質(zhì)譜恰好滿足了這樣的要求，成為藥物化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)不可缺少的檢測(cè)工具之一。本文中用到的質(zhì)譜是Waters公司的型號(hào)為Quattro microTMAPI的電噴霧電離四極桿質(zhì)譜，它的可測(cè)質(zhì)荷比范圍為2～2 000 m/z，適用于小分子化合物檢測(cè)，所以可用于藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)中間產(chǎn)物、目標(biāo)化合物以及副產(chǎn)物的定性檢測(cè)。

電噴霧電離是一種通用電離技術(shù)，在藥物研究中可以成功地分析80%以上的有機(jī)化合物，因而成為表征藥物分子的常用方法。電噴霧電離的原理是溶液經(jīng)過(guò)一根高溫和加有高電壓的毛細(xì)管后形成霧狀溶液，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，霧狀溶液的液滴帶有過(guò)量同種電荷，在高溫環(huán)境中隨著液滴溶劑的進(jìn)一步揮發(fā)，液滴逐漸變小，液滴表面電荷劇增。當(dāng)電荷之間的靜電排斥力與液滴的表面張力相等時(shí)，液滴發(fā)生崩解，形成更小的液滴，此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行，最終形成氣相離子進(jìn)入質(zhì)量分析器［2］。

四極桿性能穩(wěn)定可靠、造價(jià)低，是最常見(jiàn)的與電噴霧電離離子源連接的質(zhì)量分析器，該分析器由四根平行的金屬桿組成。四根金屬桿分成2組，一組加上直流電壓，另一組加上具有一定振幅與頻率的交流電壓。只有質(zhì)荷比適于四極桿電壓和頻率要求的離子才可以沿金屬桿之間的軸線飛行到達(dá)檢測(cè)器。不能滿足這種要求的離子將與金屬桿相撞，中和電性，成為不帶電荷的氣體分子被真空泵抽出系統(tǒng)。有規(guī)律地改變加在四極桿上的電壓或頻率，在檢測(cè)器上便可記錄到不同質(zhì)荷比的離子信號(hào)，完成質(zhì)譜測(cè)定［3］。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Quattro microTMAPI電噴霧電離四極桿質(zhì)譜(美國(guó)，Waters公司);2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);軟件為masslynx 4.0;1810-B型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器(常州國(guó)華電器有限公司)。

甲醇為色譜純(中國(guó)百靈威公司);實(shí)驗(yàn)用水為三蒸水;0.45 μm針式過(guò)濾器(英國(guó)Whatman公司)。實(shí)驗(yàn)樣品為藥物化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到的中間產(chǎn)物、目標(biāo)化合物。

1.2 樣品準(zhǔn)備

取微克級(jí)樣品用可揮發(fā)溶劑溶解，通常使用的溶劑為色譜甲醇、色譜乙腈、色譜異丙醇或超純水，不具備制作超純水的條件也可以使用三蒸水。對(duì)于甲醇、乙腈、異丙醇和水都不溶的少數(shù)樣品可使用少量四氫呋喃或氯仿將樣品溶解后用甲醇或乙腈稀釋后再進(jìn)樣。

樣品充分溶解后要根據(jù)溶劑選擇有機(jī)相或水相針式過(guò)濾器對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾，用過(guò)濾后的樣品直接進(jìn)樣。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源，毛細(xì)管電壓為3 kV;錐孔電壓根據(jù)樣品性質(zhì)在10～100 V之間調(diào)諧;源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為350℃;脫溶劑氣和錐孔氣為氮?dú)?，脫溶劑氣流量?50 L/h，錐孔氣流量為50 L/h;直接進(jìn)樣時(shí)將樣品帶入質(zhì)譜的流動(dòng)相水的比例為30%，甲醇的比例為70%，流速設(shè)為0.2 mL/min;進(jìn)樣量為 10 μL。

1.4 Quattro microTMAPI電噴霧電離四極桿質(zhì)譜直接進(jìn)樣過(guò)程

(1)根據(jù)樣品性質(zhì)選擇電噴霧電離的正負(fù)模式。

(2)用微量注射器取樣品溶液約100 μL，將注射器固定在六通閥的接口上旋緊。

(3)按MS tune界面左下角Acquire按鈕，在彈出對(duì)話框中，編輯掃描模式、樣品名和掃描的質(zhì)核比范圍，按Start按鈕開(kāi)始采集離子流信號(hào)，按六通閥右側(cè)Load按鈕，推注射器進(jìn)樣約30～50 μL，然后按Inject按鈕進(jìn)樣。

(4)在Chromatogram界面采集總離子流信號(hào)并去除本底離子流信號(hào)，在Spectrum界面得到質(zhì)譜圖。

(5)得到滿意的質(zhì)譜圖后，點(diǎn)擊MS Tune界面快捷按鈕欄上的“手”標(biāo)志按鈕，終止離子信號(hào)采集進(jìn)程。

(6)每做完一個(gè)樣品，清洗微量注射器10～15次，清洗六通閥上的定量環(huán)3～4次。

2 結(jié)果

如果樣品經(jīng)過(guò)充分的分離純化，樣品能夠充分溶解，樣品的電離效率也比較理想，質(zhì)譜的參數(shù)設(shè)置恰當(dāng)?shù)脑?，就可以得到一張比較理想的全掃描質(zhì)譜圖?？梢钥吹酱郎y(cè)樣品的準(zhǔn)分子離子峰就是基峰，雜質(zhì)離子峰和噪音峰強(qiáng)度很弱，樣品濃度較大時(shí)還可以看到強(qiáng)度較低的二聚體的準(zhǔn)分子離子峰，相對(duì)分子質(zhì)量較大的化合物還可以看到三聚體帶兩個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰。錐孔電壓參數(shù)設(shè)置恰當(dāng)可以減弱目標(biāo)離子的碎片離子信號(hào)強(qiáng)度，避免對(duì)全掃描質(zhì)譜圖解析造成干擾。但如果想進(jìn)一步得到目標(biāo)離子的碎片離子信息則還需要對(duì)目標(biāo)離子進(jìn)行子離子掃描，通過(guò)調(diào)諧碰撞室的碰撞能量獲得理想的子離子掃描質(zhì)譜圖。

3 討論

樣品的濃度、基質(zhì)、pH值、化合物的表面活性、流動(dòng)相的流速、質(zhì)譜參數(shù)等許多因素會(huì)對(duì)電噴霧電離的離子信號(hào)強(qiáng)度有影響［4-6］。以下是結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)電噴霧電離四極桿質(zhì)譜定性檢測(cè)化合物的實(shí)驗(yàn)條件的探討。

3.1 樣品需要純化

電噴霧電離非常靈敏，樣品需要進(jìn)行純化，盡量消除樣品和溶劑中的各種鹽和雜質(zhì)，避免化學(xué)噪聲和電離抑制。

樣品中鹽的濃度太高會(huì)抑制電離，一般要求揮發(fā)性無(wú)機(jī)鹽濃度應(yīng)小于20 mmol/L，不揮發(fā)性無(wú)機(jī)鹽濃度應(yīng)小于5 mmol/L。

表面活性劑存在于洗滌劑中，使用洗滌劑洗過(guò)的瓶皿處理樣品會(huì)將表面活性劑帶入樣品，表面活性劑雖然會(huì)降低液滴表面張力，能增加從噴霧液滴中釋放出離子，但其又具有較高的質(zhì)子親和力，通過(guò)和樣品離子爭(zhēng)奪質(zhì)子會(huì)降低樣品離子信號(hào)的靈敏度。

此外樣品中含有的不揮發(fā)物質(zhì)可能會(huì)污染質(zhì)譜元件，會(huì)對(duì)其他樣品的質(zhì)譜圖造成干擾。例如藥物化學(xué)有機(jī)合成的樣品常常會(huì)有三乙胺存在，這種物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為101 000，電噴霧電離正離子模式時(shí)在質(zhì)譜圖上會(huì)看到強(qiáng)度很高的質(zhì)荷比為102的加氫的準(zhǔn)分子離子峰，這種情況下如果想觀察質(zhì)荷比200以下的離子，就很困難，而且三乙胺會(huì)存留在質(zhì)譜中較難除去對(duì)后面的樣品質(zhì)譜圖造成的干擾，所以樣品要盡量純化。

3.2 所需樣品量

樣品量一般取微克級(jí)即可。樣品量過(guò)少可能造成檢測(cè)不到目標(biāo)化合物或質(zhì)譜圖的基線噪音強(qiáng)度太高而影響譜圖效果。樣品量過(guò)多則會(huì)出現(xiàn)離子信號(hào)過(guò)飽和，離子源內(nèi)電流過(guò)大產(chǎn)生放電現(xiàn)象損傷儀器，而且多余樣品殘留會(huì)污染質(zhì)譜不易清洗，還會(huì)對(duì)后面的樣品造成干擾。但有些樣品離子化效率高，較低濃度下也能得到很好的離子信號(hào)，而有些離子化效率低的樣品則需要適當(dāng)加大濃度或調(diào)節(jié)pH值促使目標(biāo)離子峰信號(hào)增強(qiáng)，這時(shí)則需要根據(jù)實(shí)際情況決定樣品量。

3.3 樣品的溶劑

溶解樣品的溶劑通常使用甲醇、乙腈、異丙醇和水。甲醇、乙腈和異丙醇要選用色譜純?cè)噭?，避免試劑中的本底離子對(duì)質(zhì)譜結(jié)果造成干擾。建議使用超純水，超純水是應(yīng)用蒸餾、去離子化、反滲透等技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)的水，這種水中除了水分子外，幾乎沒(méi)有什么雜質(zhì)。用于質(zhì)譜分析也是為了避免水中的本底離子對(duì)質(zhì)譜分析結(jié)果造成干擾。由于制造超純水的成本較高，有的實(shí)驗(yàn)室不具備制造超純水的條件，如果三蒸水中的本底離子沒(méi)有對(duì)質(zhì)譜結(jié)果造成干擾則使用三蒸水也可以。對(duì)于甲醇、乙腈、異丙醇和水都不溶的少數(shù)樣品可以使用四氫呋喃或氯仿做溶劑，但這些溶劑會(huì)促使質(zhì)譜的塑料管路和橡膠墊圈老化，所以要加少量這類溶劑將樣品溶解后用甲醇或乙腈稀釋后再進(jìn)樣。

3.4 樣品的pH值

pH值是影響電噴霧電離的重要因素。有些樣品通過(guò)調(diào)整pH值可以得到理想的目標(biāo)分子離子峰。堿性化合物用正離子模式檢測(cè)，可以用有機(jī)酸調(diào)整pH值，酸性化合物用負(fù)離子模式檢測(cè)，可以用堿調(diào)整pH值。調(diào)整pH值的有機(jī)酸一般用甲酸或乙酸，堿一般用氫氧化銨。強(qiáng)腐蝕性和不易揮發(fā)的酸堿不能用，會(huì)損壞污染質(zhì)譜元件。高效液相常用的三氟醋酸不能用，它會(huì)明顯抑制陰離子電噴霧電離，而當(dāng)三氟醋酸超過(guò)0.01%的水平時(shí)，也會(huì)在一定程度上抑制陽(yáng)離子電噴霧電離。

3.5 樣品的過(guò)濾

質(zhì)譜的進(jìn)樣管路很細(xì)小，為防止溶液中的顆粒堵塞進(jìn)樣管路，樣品充分溶解后要根據(jù)溶劑選擇有機(jī)相或水相的針式過(guò)濾器過(guò)濾，用過(guò)濾后的樣品進(jìn)樣。在選擇針式過(guò)濾器的時(shí)候需要注意，需要先用空白溶劑用針式過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)樣，查看過(guò)濾后的本底離子，有些濾膜使用溶劑過(guò)濾后會(huì)產(chǎn)生一些強(qiáng)度很高的本底離子，會(huì)對(duì)質(zhì)譜結(jié)果造成干擾，影響化合物的分析。所以要選擇對(duì)質(zhì)譜結(jié)果本底干擾小的針式過(guò)濾器。

3.6 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

用電噴霧電離四極桿質(zhì)譜檢測(cè)樣品時(shí)需要對(duì)離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)諧，調(diào)諧的目的是得到較強(qiáng)的目標(biāo)分子離子峰。當(dāng)用電噴霧電離四極桿質(zhì)譜進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)化合物進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，每一個(gè)離子源參數(shù)都要進(jìn)行優(yōu)化調(diào)諧。而利用直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行大量藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)中間產(chǎn)物、目標(biāo)化合物以及副產(chǎn)物等小分子化合物的快速定性檢測(cè)時(shí)，如果每做一個(gè)樣品都將所有參數(shù)優(yōu)化一遍不但浪費(fèi)樣品而且十分耗時(shí)。所以直接進(jìn)樣時(shí)一般只需調(diào)諧錐孔電壓，其他參數(shù)設(shè)置在相對(duì)合適的范圍內(nèi)通常就可以得到理想的結(jié)果。下面對(duì)部分可以調(diào)諧的參數(shù)做一下簡(jiǎn)要說(shuō)明:

(1)毛細(xì)管電壓:在探頭內(nèi)部的毛細(xì)管上加上高電壓，高電壓使樣品液滴帶上過(guò)量電荷，從而離子化。電壓值過(guò)低會(huì)導(dǎo)致樣品的離子化效率低，電壓值過(guò)高則容易引起放電現(xiàn)象。通常在2～4 kV之間優(yōu)化，直接進(jìn)樣時(shí)通常設(shè)為3 kV。

(2)錐孔電壓:錐孔電壓對(duì)電噴霧電離的信號(hào)強(qiáng)度影響較大，也是直接進(jìn)樣時(shí)通常需要調(diào)諧的參數(shù)。加大錐孔電壓會(huì)增加離子間的碰撞，使離子進(jìn)入檢測(cè)器的速度加快，離子損失小，檢測(cè)靈敏度高，離子信號(hào)增強(qiáng)，但會(huì)發(fā)生源內(nèi)裂解，產(chǎn)生碎片離子。降低錐孔電壓，則檢測(cè)的靈敏度會(huì)變低，但產(chǎn)生的碎片離子會(huì)減少。通過(guò)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)一般相對(duì)分子質(zhì)量在100 000～400 000的化合物錐孔電壓可以在10～30 V之間優(yōu)化，相對(duì)分子質(zhì)量在400 000～700 000的化合物錐孔電壓可以在30～50 V之間優(yōu)化，相對(duì)分子質(zhì)量在700 000～1 950 000的化合物可以在50～150 V之間優(yōu)化。但有少數(shù)化合物并不符合上述規(guī)律，有的化合物相對(duì)分子質(zhì)量較小卻需要較大的錐孔電壓才能得到理想強(qiáng)度的分子離子峰，而有的化合物相對(duì)分子質(zhì)量較大卻需要相對(duì)較小的錐孔電壓，在實(shí)際工作中應(yīng)該注意這樣的情況。

(3)源溫度:源溫度設(shè)定主要根據(jù)進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相的流速大小和流動(dòng)相含水比例高低來(lái)決定，如果流動(dòng)相流速較大、流動(dòng)相含水的比例高、不容易氣化則需要較高的源溫度。通常在80℃ ～120℃之間優(yōu)化。直接進(jìn)樣時(shí)需要利用高效液相的流動(dòng)相將樣品帶入質(zhì)譜，通常將流動(dòng)相水的比例設(shè)為30%，甲醇的比例設(shè)為70%，流速設(shè)為0.2 mL/min，源溫度設(shè)為120℃。

(4)脫溶劑氣溫度:脫溶劑氣溫度設(shè)定也要根據(jù)進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相的流速大小和流動(dòng)相含水比例高低來(lái)決定，如果流動(dòng)相流速較大、流動(dòng)相含水的比例高、不容易氣化則需要較高的脫溶劑氣溫度。通常在120℃～300℃之間優(yōu)化。直接進(jìn)樣時(shí)流動(dòng)相水的比例為30%，甲醇的比例為70%，流速設(shè)為0.2 mL/min，脫溶劑氣溫度設(shè)在200℃。

(5)脫溶劑氣流量:脫溶劑氣主要的作用是去除溶劑。樣品需要利用流動(dòng)相帶入質(zhì)譜，如果流動(dòng)相流速大、流動(dòng)相含水的比例高、不容易氣化則脫溶劑氣流量應(yīng)大些。通常在300～1 000 L/h之間優(yōu)化。直接進(jìn)樣時(shí)一般設(shè)為350 L/h。

(6)錐孔氣流量:錐孔氣的主要作用是去除樣品中的中性分子。通常在0～100 L/h之間優(yōu)化。直接進(jìn)樣時(shí)一般設(shè)為50 L/h。

電噴霧四極桿質(zhì)譜是環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生、醫(yī)藥等領(lǐng)域中重要的檢測(cè)工具［7-10］。有機(jī)化合物的定性檢測(cè)是電噴霧電離四極桿質(zhì)譜最基本的應(yīng)用技術(shù)，掌握起來(lái)并不難。對(duì)于已知化合物，根據(jù)它的相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)特性就可以基本確定實(shí)驗(yàn)條件，得到較理想的質(zhì)譜圖。而對(duì)于未知樣品則需要在正負(fù)電噴霧電離模式下都進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)結(jié)果再參考以上所述對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整，最終得到理想的質(zhì)譜圖。

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