武文琦 叢旭珍 殷愛(ài)紅 胡 家 翟方麗 李慎濤*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)和免疫學(xué)系，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069;3.青島阜外心血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科，青島266034)

變異鏈球菌(streptococcus mutans)是齲病的主要致病菌，也是某些非口腔疾病(如亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎)的病原菌，具有廣泛的適應(yīng)能力，可以持續(xù)存在于口腔中。在世界范圍內(nèi)，不同種族、不同社會(huì)經(jīng)濟(jì)背景的人群中均可分離出此菌，但并非所有人都表現(xiàn)齲病。研究［1］顯示，不同齲指數(shù)患者口腔變異鏈球菌的體外致齲能力不同，提示不同菌株的致齲性是不同的，而致齲性主要是通過(guò)其毒力因子來(lái)完成的，但其感染途徑和致病機(jī)制至今尚未得到滿意的解答。隨著S.mutans UA159基因組測(cè)序工作的完成，相關(guān)的理論研究［4］也更加深入細(xì)致。

核糖-5-磷酸異構(gòu)酶也叫D-核糖-5-磷酸乙酮醇異構(gòu)酶，是自然界中廣泛存在的一種高度保守的蛋白酶，參與原核和真核生物的糖代謝(如磷酸戊糖途徑)，同時(shí)在植物二氧化碳固定的卡爾文循環(huán)中，它是催化5-磷酸核糖和5-磷酸核酮糖相互轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵酶［2-3］。這些代謝參與還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的合成以及戊糖的氧化、非氧化合成［4］。有研究［5］表明，人類(lèi)缺乏核糖-5-磷酸異構(gòu)酶會(huì)引起髓鞘的損傷，從而導(dǎo)致諸如白質(zhì)腦病以及包括周?chē)窠?jīng)病變等在內(nèi)的神經(jīng)元異常。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶以核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A(RpiA)和核糖-5-磷酸異構(gòu)酶B(RpiB)這2種類(lèi)型存在，它們都能催化5-磷酸核糖和5-磷酸核酮糖的相互轉(zhuǎn)變，但是它們卻幾乎沒(méi)有什么關(guān)聯(lián)。RpiA是自然界中最廣泛存在的，幾乎存在于所有的組織中［6］，而 RpiB卻只在細(xì)菌和真核物種中發(fā)現(xiàn)［7］。RpiA和RpiB能夠催化相同的反應(yīng)并且在大部分的器官中至少存在一種。盡管核糖-5-磷酸異構(gòu)酶的重要性早已被確定，但對(duì)RpiA和RpiB的催化機(jī)制卻所知甚少。

本文中所研究的rpiA由變異鏈球菌(streptococcus mutans，Smu)UA159株基因組所編碼，相對(duì)分子約為24 000。此菌屬革蘭陽(yáng)性菌，是最主要的齲齒致病菌之一。對(duì)rpiA克隆、表達(dá)與純化將有助于闡明其生物學(xué)功能，通過(guò)尋找其相互作用蛋白及小分子化合物，為進(jìn)一步研制抗變異鏈球菌的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

Streptococcus mutans UA159由北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院郭麗紅教授惠贈(zèng);原核表達(dá)載體pGEX-6p-1、大腸桿菌克隆菌株XL-1及表達(dá)菌株BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存;DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司(美國(guó));DNA片段膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omiga公司;Glutathione SepharoseTM4B購(gòu)自美國(guó) GE公司;Sephadex G25、Resource Q預(yù)裝柱購(gòu)自美國(guó)GE公司。引物合成及DNA測(cè)序由上海生工公司完成。

制冷恒溫?fù)u床，Thermo公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司JY92-2D;電泳儀，BIO-RAD，PowerPac3000;高速離心機(jī)，BECKMAN J2-HS;凝膠成像處理系統(tǒng)，GE healthcare Image Quant 300;AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó) GE公司; MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀，德國(guó)BRUKER公司。

1.2 方法

1)目的基因片段的擴(kuò)增：根據(jù)GenBank中變異鏈球菌UA159株基因組(AE014133)序列，設(shè)計(jì)特異性引物，分別添加BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。以UA159基因組為模板，PCR擴(kuò)增核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A的編碼序列。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

2)克隆及鑒定：將膠回收的PCR產(chǎn)物用BamHI和XhoI雙酶切，回收酶切后的片段，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的載體pGEX-6p-1按5∶1濃度混合，在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過(guò)夜，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E coli XL-1 blue，涂布到含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日從LB平板上采用抽簽法隨機(jī)挑取5個(gè)菌落，接種于含氨芐青霉素(100 mg/ L)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒再進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒測(cè)序。

3)誘導(dǎo)表達(dá)分析：用測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，采用抽簽法隨機(jī)挑取5個(gè)菌落，接種于含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日，按1∶100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到5 mL含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，誘導(dǎo)表達(dá)8～12 h，5 000 r/min離心15 min收集菌體，取適量菌體用 SDSPAGE分析蛋白表達(dá)情況。

4)蛋白表達(dá)形式分析及表達(dá)條件的優(yōu)化：分別對(duì)在不同誘導(dǎo)溫度、不同IPTG終濃度、不同誘導(dǎo)起始培養(yǎng)液OD600值及不同誘導(dǎo)時(shí)間4種條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，4 000 r/min離心15 min收集菌體，用PBS(140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.8 mmol/L KH2PO4)重懸菌體，4 000 r/min離心15 min，收集菌體，用PBS重懸菌體，加入溶菌酶(終濃度至1 g/L)、DTT(終濃度至1 mmol/ L)、PMSF(終濃度至1 mmol/L)，冰上作用30 min，然后，在冰浴上超聲至菌體完全裂解，15 000 r/min離心50 min，分別收集上清和沉淀，用SDS-PAGE分上清和沉淀中的目標(biāo)蛋白，從而確定目標(biāo)蛋白的表達(dá)形式。

5)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A工程菌接種于20 mL含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接于1 L含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600值達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，于16℃下誘導(dǎo)表達(dá)20 h，5 000 r/min離心15 min收集菌體用于目標(biāo)蛋白的純化。

6)重組蛋白的純化：將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用超聲破菌，離心收集上清，加到已用PBS平衡的Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱上，讓其自然通過(guò)柱，然后用PBS洗滌雜蛋白，用酶切緩沖液(25 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、2 mmol/LDTT，pH 7.5)平衡柱，加入200μL(1 g/L)PreScission蛋白酶，于4℃酶切過(guò)夜。次日，用 PBS洗脫，收集穿過(guò)的蛋白樣品，用15%的SDS-PAGE鑒定。

收集目標(biāo)蛋白，用Sepherdex G25柱脫鹽，緩沖液用陰離子交換A液(25 mmol/L Tris、1 mmol/L DTT，pH 7.5)，隨后將脫鹽后的蛋白樣品過(guò)Resource Q陰離子交換柱，所用緩沖液為：A液(25 mmol/L Tris、1 mmol/L DTT，pH 7.5)、B液(25 mmol/L Tris、1 mol/L NaCl、1 mmol/L DTT，pH 7.5)。收集含蛋白組分，用SDS-PAGE鑒定，將含有目標(biāo)蛋白的組分合并，利用AKTA純化儀隨機(jī)軟件對(duì)洗脫峰進(jìn)行積分并估算蛋白質(zhì)濃度。

7)目標(biāo)蛋白的質(zhì)譜分析：從SDS-PAGE膠上切取含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的條帶，經(jīng)膠內(nèi)酶解后，用MALDITOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，運(yùn)用Mascot軟件將質(zhì)譜結(jié)果在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，得出蛋白質(zhì)的可能性分?jǐn)?shù)，根據(jù)所用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定陽(yáng)性的分?jǐn)?shù)，從而判定是否為核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A蛋白。

2 結(jié)果

2.1 RpiA表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到了編碼rpiA的DNA片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小與預(yù)期的一致。將該片段和pGEX-6p-1載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1 blue，挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定，得到陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果證實(shí)為核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A蛋白編碼序列。

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白表達(dá)形式分析

將rpiA工程菌于37℃、1 mmol/L IPTG的條件下誘導(dǎo)表達(dá)20 h，超聲破碎菌體，4℃、1 5000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAG分析。在破菌沉淀中可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為40 000的融合蛋白表達(dá)條帶，大小與預(yù)期的一致，上清中也含有少量目標(biāo)蛋白，說(shuō)明rpiA能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)，但在37℃誘導(dǎo)條件下，表達(dá)產(chǎn)物主要以包含體的形式存在。

2.3 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

1)在培養(yǎng)液 OD600值等于0.8、IPTG濃度0.1 mmol/L條件下，分別在37℃、16℃誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后取破菌上清進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明16℃時(shí)目標(biāo)蛋白在上清中的表達(dá)量較大(圖1)。

圖1 目標(biāo)蛋白在不同溫度下誘導(dǎo)后的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of target protein induced with IPTG at different temperature1：before induction;2：after induction at 16℃;3：16℃ supernatant;4：before induction;5：after induction at 37℃;6：37℃supernatant;M：66 000，46 000，34 000，26 000，16 000; IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside;M：marker.

2)在培養(yǎng)液OD600值等于0.8、16℃條件下，用終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后20 h取樣SDS-PAGE，結(jié)果表明當(dāng)IPTG終濃度為0.5 mmol/L、4 mmol/L時(shí)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖2)。

3)在培養(yǎng)液OD600值等于0.8、16℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L條件下誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、20 h取樣SDSPAGE，結(jié)果表明誘導(dǎo)20 h目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖3)。

4)在IPTG終濃度為0.1 mmol/L、16℃誘導(dǎo)條件下，在培養(yǎng)液OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時(shí)誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后20 h取樣SDS-PAGE，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)液OD600值為0.6時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖4)。

由上述實(shí)驗(yàn)可知，變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件為：培養(yǎng)溫度16℃、開(kāi)始誘導(dǎo)的培養(yǎng)液OD600值等于0.6、IPTG終濃度0.5 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間20 h。

2.4 蛋白純化

將收集的菌體破碎、離心后，收集上清，進(jìn)行Glutathione SepharoseTM4B親和層析純化，得到較高純度的目的蛋白。合并后經(jīng)電泳鑒定，得到較高純度的目的蛋白(圖5)。

圖5 Glutathione SepharoseTM4B親和層析純化后目標(biāo)蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of rpiA eluted from affinity chromatographyM：marker.

利用陰離子交換進(jìn)一步純化目的蛋白，收集主峰各組分，合并后經(jīng)電泳鑒定，得到較高純度的目的蛋白(圖6)。

2.5 蛋白的質(zhì)譜鑒定

將SDS-PAGE凝膠上的樣品條帶切下進(jìn)行膠內(nèi)酶切，再進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索后，結(jié)果為變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A，得分178，是可信的匹配結(jié)果。因此從蛋白水平證實(shí)該蛋白為變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A(圖7)。

3 討論

在磷酸戊糖途徑中，核糖-5-磷酸和核酮糖-5-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的一步。磷酸糖異構(gòu)酶能夠參與催化非磷酸化的醛糖或者酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化，盡管催化效率不如它們自然的磷酸化底物高，至少在核糖-5-磷酸異構(gòu)酶中是如此［8］。由于部分糖類(lèi)異構(gòu)酶具有廣泛的底物特異性，許多酶比如6-磷酸半乳糖苷酶已經(jīng)用于罕見(jiàn)糖類(lèi)的異構(gòu)化［9］。這些異構(gòu)酶通過(guò)2種不同的異構(gòu)化反應(yīng)將一種底物轉(zhuǎn)化成2種不同的產(chǎn)物。與這些酶的異構(gòu)化反應(yīng)所不同的是，核糖-5-磷酸異構(gòu)酶催化糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)變則只是通過(guò)一種異構(gòu)化反應(yīng)。RpiA和RpiB這2種完全沒(méi)有氨基酸序列相似性的酶的催化活性首先在大腸桿菌中被確證，在研究過(guò)程中，RpiA被認(rèn)為是促進(jìn)生命活動(dòng)過(guò)程中所必須的五碳糖之間的相互轉(zhuǎn)變，而RpiB的主要作用則是促進(jìn)罕見(jiàn)六碳糖類(lèi)6-磷酸核糖和6-磷酸核酮糖的相互轉(zhuǎn)化。對(duì)于變異鏈球菌RpiA的異構(gòu)化作用及其對(duì)于底物的相對(duì)特異性選擇則需要通過(guò)相關(guān)的動(dòng)力學(xué)特征研究來(lái)得到進(jìn)一步的確證。

RpiA已經(jīng)從至少60個(gè)物種中獲得序列并且已經(jīng)在許多有機(jī)體中得到了克隆，包括大腸桿菌和菠菜。這些酶之間以及與人類(lèi)體內(nèi)的酶之間的氨基酸序列均具有30%的同源性。細(xì)菌rpiA參與細(xì)菌的磷酸戊糖途徑，對(duì)細(xì)菌的生存至關(guān)重要。變異鏈球菌是重要的致齲菌，但目前缺乏有針對(duì)性的治療藥物，對(duì)其致齲機(jī)制也缺乏深入的了解。尋找新的分子靶標(biāo)，特別是與其毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)成為目前研究的熱點(diǎn)。通過(guò)對(duì)這類(lèi)蛋白功能的進(jìn)一步研究，有望在分子水平上理解變異鏈球菌的致齲機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)有針對(duì)性的治療藥物或疫苗有極大幫助。

本研究成功地在大腸桿菌中表達(dá)了變異鏈球菌rpiA，并建立了高效純化工藝。目前正在進(jìn)行rpiA結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，探索變異鏈球菌rpiA在致齲方面的作用機(jī)制。

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