馬瑞敏 張國軍 康熙雄

(首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京 100050)

自身免疫性疾病是由于正常免疫耐受被打破，導致識別自身抗原的淋巴細胞增生活化而引起組織結(jié)構(gòu)和功能損害的一類疾病，其確切病因尚不清楚。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是近年來備受關注的一種模式識別受體，通過選擇性地識別病原體中病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的保守結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對入侵病原體的早期識別，激活天然免疫。TLRs信號還通過上調(diào)抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)表面的共刺激分子及其分泌的炎性細胞因子，誘導T、B淋巴細胞向效應細胞分化，進而調(diào)節(jié)獲得性免疫［1-2］。TLRs信號是機體抵抗外界感染的第一道防線，但信號的過度活化也可引起級聯(lián)反應，打破機體對自身抗原的免疫耐受，促進自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。而隨著對TLRs研究的深入，也將對自身免疫性疾病的治療提供理論基礎及新的藥物靶點。

1 TLRs的種類及配體

TLRs是一類跨膜受體，現(xiàn)已在人和小鼠體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)13種TLRs［3］，主要分布于免疫細胞及同外界相通的腔道上皮細胞表面，在巨噬細胞、樹突狀細胞等專職抗原提呈細胞表面的表達尤其豐富。TLRs通過識別相應的配體來激活免疫反應。在TLRs家族中，TLR1、2、6、10 主要識別細菌脂蛋白;TLR3、4、5 分別識別雙鏈RNA、脂多糖、鞭毛蛋白;TLR7、8、9主要識別核酸分子;TLR11、12、13識別肌動蛋白樣分子。

除外源性配體外，TLRs還可識別某些內(nèi)源性分子。熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)是第一個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性配體［4］。Lehnardt S 等［5］發(fā)現(xiàn)，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)壞死或凋亡的細胞中釋放出來的HSP60可通過TLR4信號途徑誘導小膠質(zhì)細胞合成神經(jīng)毒性氮氧化合物，在野生型小鼠中，HSP60可促進軸突脫失和神經(jīng)元凋亡，但在TLR4或其信號通路中下游蛋白髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)突變的小鼠中則無此作用。此后發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性配體包括一些細胞內(nèi)分子(如 HSP70、HSP90、高遷移率族蛋白1、尿酸等)、核酸(如polyI:C、dsRNA、鳥苷類似物、DNA/抗體復合物等)、細胞外基質(zhì)成分(如透明質(zhì)酸、硫酸肝素、纖黏連蛋白)等［6］。這些危險信號多來自損傷變性、壞死或凋亡的細胞，它們的發(fā)現(xiàn)提示TLRs有可能參與自身免疫耐受和免疫監(jiān)視，對自身免疫病的發(fā)生起關鍵作用。

2 TLRs信號通路和功能調(diào)節(jié)

除了TLR3和部分TLR4的信號轉(zhuǎn)導通路不依賴MyD88，多數(shù) TLRs信號中都有 MyD88的參與。MyD88首先通過Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)與 TLRs相結(jié)合，接著募集下游信號分子白介素1受體相關蛋白激酶(IL-1R associated kinase，IRAK)4，IRAK-4 磷酸化激活 IRAK-1，隨后活化腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNFR-associated factor 6，TRAF6)?；罨腡RAF6具有泛素連接酶的活性，能夠結(jié)合泛素結(jié)合酶，這種泛素化降解可以活化 TGF-β 激酶(TGF-β activated kinase 1，TAK1)和 TAK1結(jié)合蛋白(TAK1 binding protein，TAB)?；罨腡AK1會催化人核因子κB抑制物激酶β(human inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β，IKK-β)磷酸化，最終激活核因子(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，促進炎性因子的表達。而含Toll/IL-1受體接頭蛋白分子(Toll/IL-1 receptor-containing adaptor molecule，TRIF)和TRIF相關接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)則介導了MyD88非依賴途徑，TRIF對TLR3和TLR4的信號轉(zhuǎn)導都相當重要，可以活化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF-3)，隨后合成干擾素 β(interferon β，IFN-β)，然后引起一些IFN誘導基因的表達，而TRAM僅在TLR4的途徑中發(fā)揮作用［7］。

TLRs的激活一方面可通過刺激先天性免疫應答和提高獲得性免疫反應來保護機體，但它引起的持續(xù)性炎性反應也會對機體產(chǎn)生損傷，自身免疫、慢性炎癥及一些感染性疾病都與它有一定關系［8］。因此TLRs的激活必須受到嚴格的負調(diào)控，以保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定?？扇苄缘腡LRs是一類胞外負調(diào)控因子，可封閉膜表面TLRs與配體的結(jié)合，抑制TLRs信號通路?？缒へ撜{(diào)控分子根據(jù)作用原理可分為促使連接復合體的解離，如腫瘤發(fā)生抑制物2可促使MyD88與MyD88-接頭蛋白相似物(MyD88-adaptor like，Mal)解離;干擾功能復合體的形成，如單免疫球蛋白IL-1相關受體(single immunoglobulin IL-1 related receptor，SIGIRR)可分別與IRAK和TRAF形成復合體，從而干擾后兩者形成復合物等。而胞內(nèi)也存在眾多負調(diào)控因子，主要以泛素化降解、去泛素化、競爭性抑制等方式行使負調(diào)控功能［9］。

3 TLRs與自身免疫性疾病

3.1 TLRs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病程反復、累及多種器官的自身免疫性疾病，其免疫學特征主要是產(chǎn)生高滴度的自身抗體，伴隨抑制性T淋巴細胞減少及自身反應性B淋巴細胞增多，但機制尚未完全清楚。在SLE發(fā)病機制中，TLR7和TLR9起重要作用。實驗［10］證明，SLE患者外周血單個核細胞TLR7 mRNA、TLR9 mRNA量高于正常對照組。Papadimitraki E D等［11］發(fā)現(xiàn)活動期狼瘡患者外周血中表達TLR9的記憶B細胞和漿細胞比例明顯高于穩(wěn)定期患者，且此種B細胞的量與血清中抗dsDNA的量呈正相關，可能是凋亡細胞釋放的內(nèi)源性核酸分子通過TLR9刺激B細胞的免疫反應參與了SLE的發(fā)病。進一步的體外研究［12］顯示，IgG2a在易患自身免疫性疾病的鼠AM14B細胞中表達，而DNA、含有DNA的蛋白質(zhì)或RNA及含有RNA的蛋白質(zhì)均可與IgG2a結(jié)合，進一步同B細胞受體(B cell receptor，BCR)結(jié)合，導致AM14B細胞增生。該研究證實足夠數(shù)量的自身抗原與BCR結(jié)合后，通過TLR7、TLR9激活原本處于靜止狀態(tài)的自身免疫性B細胞，產(chǎn)生自身抗體。這些自身抗體可直接攻擊組織器官發(fā)生壞死脫落，壞死的組織細胞成分又可繼續(xù)作為TLRs的配體，激活更多的B細胞，從而形成正反饋循環(huán)。而在動物模型中，缺乏TLRs銜接蛋白MyD88的鼠則不能產(chǎn)生高滴度的自身抗體。

SLE 患者血清中干擾素 α(interferon α，IFN-α)濃度升高，而一些本身不伴有自身免疫性疾病的患者經(jīng)IFN-α治療后會出現(xiàn)抗核抗體、抗dsDNA抗體，甚至SLE綜合征。人漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoid den-dritic cell，pDC)被認為是產(chǎn)生 IFN-α 的主要細胞［13］。TLRs介導的pDC激活后，可分泌大量的IFN-α，IFN-α通過一系列反應，刺激自身反應性B細胞產(chǎn)生自身抗體，同時活化細胞毒性T細胞產(chǎn)生自身抗原。自身抗原、抗體構(gòu)成免疫復合物，被TLRs識別，又可誘導新的IFN-α 產(chǎn)生［14-15］。TLRs 還可誘導合成 IL-1、IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α等，參與調(diào)節(jié)特異的免疫反應。

3.2 TLRs與自身免疫性肝病

自身免疫性肝病系機體自身免疫反應過度造成肝組織損傷的疾病，主要包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和變異綜合征(proteus syndrome，PS)等，其發(fā)病可能與遺傳易感性和分子模擬機制有關。近年來，TLRs在疾病中的作用受到關注。有研究［16］顯示，AIH、PBC患者膽管上皮細胞表達TLR3高于正常人，而Zhao J等［17］發(fā)現(xiàn)在PBC患者肝組織中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)表達水平增高，對于敏感個體，LPS可能是PBC發(fā)病的一種誘導因素。在LPS的刺激下，PBC患者單個核細胞和膽管上皮細胞TLR4、NF-kB表達及產(chǎn)生的細胞因子明顯增多，提示TLRs信號通路可能在PBC發(fā)病中起作用。

由于天然生成的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)在維持外周免疫耐受中起重要作用，因此CD4+CD25+Tregs在自身免疫性肝病發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。有研究［18］顯示，給野生型小鼠注射TLR2配體可導致Tregs數(shù)量顯著增加;Tregs暴露于TLR4配體LPS可誘導幾種活化標志物(CD69、B7.1、CD44、CD38 等)的上調(diào)，并增強 Tregs的存活和增生能力;而用LPS治療可使Tregs的免疫抑制能力增加10倍，LPS活化的Tregs可以有效控制初始CD4+T細胞活化及由此產(chǎn)生的疾病。這提示在自身免疫性肝病發(fā)病過程中，TLRs信號系統(tǒng)被激活，進而影響Tregs功能，參與疾病的發(fā)生。

3.3 TLRs與脫髓鞘性疾病

常見的自身免疫性脫髓鞘疾病包括累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)和累及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)。實驗性自身免疫性腦炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)和實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)分別是其穩(wěn)定的動物模型。這類疾病有共同的組織病理學特征，即血管周圍的單核細胞浸潤、脫髓鞘和水腫。研究［19］顯示TLR9參與EAE的發(fā)病:在細菌、病毒感染或組織損傷的情況下，TLR9與配體結(jié)合激活APC，激活自身反應性T細胞，使其分化為效應細胞而導致EAE，隨著病程的進展可以觀察到，TLR9和MyD88缺陷動物則不發(fā)生EAE，提示TLR9和MyD88參與了EAE的發(fā)病。Zhang Z Y等［20］報道了在EAN鼠巨噬細胞中TLR2、CD14和HSP70都呈高表達，并與疾病嚴重程度相關聯(lián)，而以其為基礎的負向調(diào)控可能是控制疾病發(fā)展的免疫途徑。Deng Y N等［21］則報道了EAN鼠坐骨神經(jīng)中TLR9的高表達狀態(tài)。也有研究［22］顯示tlr4基因多態(tài)性與GBS發(fā)病易感性的關系，認為Thr399Lle是GBS中AMAN亞型的易患基因型。而對于MS和GBS患者，TLRs在發(fā)病中所起作用的相關研究則較少。

4 TLRs與自身免疫性疾病的治療

TLRs在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，因此以TLRs及其信號通路為靶點的干預治療也引起了研究者極大的興趣。Barrat F J和同事［23］研究了一種人工合成的寡核苷酸，稱為免疫調(diào)節(jié)序列(immunoregulatory sequence，IRS)。IRS 869是 TLR9活化的抑制劑，能與其特異結(jié)合而阻斷TLR9及下游信號的激活。他們的研究顯示，給小鼠注射免疫刺激序列(immunostimulatory sequence，ISS)和 D-半乳糖胺可以引起嚴重的炎性反應甚至在幾天內(nèi)死亡，但注射IRS 869后可明顯減輕炎癥并延長生存期，對TLR7的研究也得到了相似的結(jié)果。之后Barrat F J等［24］更進一步研究了可以同時抑制TLR7和TLR9的寡脫氧核苷酸序列(oligo-deoxynucleotide，ODN)，這些序列可減輕炎癥，并抑制漿細胞樣樹突細胞產(chǎn)生IFN-α。給狼瘡鼠注射ODN，發(fā)現(xiàn)抗核抗體產(chǎn)生減少，狼瘡性腎炎減輕，生存期明顯延長。

在TLRs信號通路下游可作為治療靶點的蛋白包括MyD88、TRAF6、IRAK1和IRAK4等。兩個研究小組分別發(fā)現(xiàn)抑制MyD88可以影響通路中激酶的磷酸化和NF-kB的激活，同時影響IRAK1和IRAK4的募集反應，這說明MyD88作為TLRs通路的中樞性介質(zhì)，其抑制劑可有效拮抗異常的TLRs信號，降低炎性反應及 IFN-α 的產(chǎn)生［25-27］。Song K W 等［28］報道了 IRAK1和IRAK4的雙重抑制劑RO0884可有效抑制IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，而通過RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)，IRAK1與TNF-α的產(chǎn)生相關，IRAK4和IL-1β的產(chǎn)生相關。這提示IRAK1/IRAK4抑制劑可阻斷異常信號通路，減少炎性細胞因子的產(chǎn)生，在自身免疫疾病的治療中有重要的潛在價值。

5 展望

隨著對TLRs信號通路認識的逐步深入，基于TLRs為靶點的治療探討也成為研究的熱點。根據(jù)疾病的發(fā)病機制和發(fā)展階段選擇合適的TLRs激動劑或阻滯劑進行治療是有效的，但也仍有一些問題需要解決:由于機體免疫反應的復雜性和TLRs影響的廣泛性，基于TLRs的藥物可能帶來嚴重的不良反應，因此如何控制藥物的治療作用和不良反應之間的平衡是此類藥物面臨的關鍵問題;很多研究結(jié)果來源于動物模型，而TLRs在人類疾病中的作用還有待更進一步的研究。

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