游朝勇綜述 馮一中審校

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱應(yīng)激蛋白(stress protein，sp)，是生物體細胞在熱誘導(dǎo)下合成的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)[1]。近年來，HSPs被發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及預(yù)后關(guān)系密切。

1 HSP70的研究進展

1.1 HSP70的發(fā)現(xiàn)及演變過程

1962年，Ritossa把25℃培育的果蠅幼蟲置于32℃熱環(huán)境中，30 min后發(fā)現(xiàn)果蠅唾液腺染色體上出現(xiàn)膨突(puff)，提示該區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄增強，推測有新的蛋白質(zhì)合成，Ritossa稱之為熱休克反應(yīng)。1974年，Tusseres用SDS--PAGE電泳放射自顯影發(fā)現(xiàn)，置于熱環(huán)境中的果蠅唾液腺、腦及其它組織中，許多正常蛋白質(zhì)的合成減少，卻合成一組特殊的蛋白質(zhì)，從而證實了溫度增高而引起的果蠅染色體產(chǎn)生的“膨突”是由于熱休克反應(yīng)激發(fā)了染色體內(nèi)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，合成了特異的蛋白質(zhì)，并命名為“熱休克蛋白”。進入80年代后，Pelbam于1986年提出了HSP是1種分子伴侶的理論；Nover與Soger分別于1984年和1987年闡明了編碼HSP的序列、基因結(jié)構(gòu)及其位點，并且確定了是由于高熱影響到該基因中保守的上游調(diào)節(jié)序列，即熱休克元件(heat shock element，HSE)而引起熱休克應(yīng)答，從而編碼轉(zhuǎn)錄合成HSP，將HSP功能與調(diào)控的研究上升到了1個新的高度。

1.2 HSP的分類及HSP70分子結(jié)構(gòu)

現(xiàn)已證明幾乎所有的活細胞都可被誘導(dǎo)出熱休克蛋白，在多種多樣的應(yīng)激因素中，除了非致死性熱休克外，還包括一些應(yīng)激原如環(huán)境低溫、缺氧、重金屬中毒、氧化應(yīng)激、感染、饑餓、創(chuàng)傷、代謝毒物、氧化反應(yīng)、化學(xué)物質(zhì)(如乙醛、亞砷酸鈉等)、放射線、某些線粒體呼吸鏈抑制劑、癲癇以及某些藥物(如鉀離子通道激動劑，腺苷受體激動劑等)。在應(yīng)激條件誘導(dǎo)下，HSP基因高效表達的熱休克蛋白，是廣泛存在于生物界中高度保守的一組蛋白質(zhì)[2]。HSPs在體內(nèi)可與多種蛋白形成復(fù)合體，陪伴蛋白分子在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、跨膜，參與蛋白質(zhì)的折疊與伸展、多聚復(fù)合體的組裝，發(fā)揮其調(diào)節(jié)靶蛋白的作用，但又不改變靶蛋白的結(jié)構(gòu)[3]，故熱休克蛋白又被稱作“分子伴侶[4]”(molecularchaperone)。HSPs分為6個家系，分別是：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素。在眾多的熱休克蛋白中分子量為70 kD左右的HSP70家族，是被研究的較為深入的1種。按照其表達情況將HSP70分為構(gòu)成型和誘導(dǎo)型，而構(gòu)成型HSP70又可分為2種，分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)。HSP70家族分成：① HSP73(組成型HSP70)，分布于胞核與胞質(zhì)；② HSP72(誘導(dǎo)型HSP70)，分布于胞核與胞質(zhì)；③ GRP78，分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)；④ GRP75，分布于線粒體中。其中HSP73和HSP72的同源性達95%，HSP73，GRP75，GRF78存在于非應(yīng)激的正常細胞中，正常細胞中即可表達，而HSP72僅出現(xiàn)在應(yīng)激細胞中。各種生物的HSP70及其編碼基因均具有進化上的高度保守性，原核生物和真核生物的HSP70有40%～60%的同源性，而不同來源的真核生物其同源性為60%～78%。人類的HSP70相關(guān)基因定位于第6號染色體短臂、第14號和第21號等多條染色體上。

HSP70蛋白分為3個結(jié)構(gòu)域：氨基端(1-383)的ATP結(jié)合域(ATPbindingdomain，ATP-BD)，有ATP酶活性，可使ATP水解，較C端具有更高的保守性；中心區(qū)(384-542)的肽結(jié)合部位(peptide binding domain，PBD)，可結(jié)合新生肽段，受損的蛋白質(zhì)；羧基端(543-646)高度保守的末端順序，可影響HSP70 mRNA 翻譯的數(shù)量。

1.3 HSP70生物學(xué)功能

HSP70主要的生物學(xué)功能是在應(yīng)激狀態(tài)下保護細胞生命活動必需的蛋白質(zhì)以維持細胞的生存，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：①結(jié)合其他蛋白質(zhì)，介導(dǎo)其他蛋白質(zhì)的折疊和裝配；②蛋白質(zhì)的定位和轉(zhuǎn)運；③參與蛋白質(zhì)的水解，防止蛋白質(zhì)聚集；④參與細胞骨架和核骨架之中，活化其他細胞基因；⑤與癌基因或抑癌基因蛋白作用，參與腫瘤的發(fā)生、增殖分化及抗腫瘤免疫。HSP70的作用具有以下特點：①HSP70正常狀態(tài)下水平較低，而應(yīng)激狀態(tài)下表達顯著提高；②平時HSP70主要存在于胞質(zhì)中，應(yīng)激時HSP70迅速進入胞核；③多種因素可誘導(dǎo)HSP70大量產(chǎn)生，具有應(yīng)激反應(yīng)普遍性，其誘導(dǎo)合成在轉(zhuǎn)錄和翻譯2個水平上調(diào)節(jié)；④HSP70能提高細胞抗應(yīng)激能力，如HSP70生成量與細胞的熱耐受能力呈正相關(guān)。

2 HSP70與惡性腫瘤的關(guān)系

2.1 HSP70與腫瘤細胞增殖

作為熱休克蛋白家族中的重要成員，HSP70能促進腫瘤細胞的生長。HSP70在多種腫瘤組織中表達異常[5]，與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，腫瘤免疫，腫瘤治療中耐藥性和腫瘤的預(yù)后等都有密切關(guān)系。HSP70與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)引起廣泛的重視。腫瘤是機體在內(nèi)，外因素相互作用下發(fā)生的與機體生長不協(xié)調(diào)的異常增殖群，具有無限增殖的特點，其自身增長需要大量HSP70來調(diào)節(jié)。正常細胞僅表達少量HSP70，HSP70參與細胞的生長代謝，并受細胞周期的嚴(yán)格調(diào)控；而腫瘤細胞即使在無應(yīng)激條件下，也能獨立于細胞周期持續(xù)高表達誘導(dǎo)型HSP70，并出現(xiàn)異常分布和定位。如卵巢癌細胞中HSP70的表達較正常卵巢細胞高幾倍[6]，免疫組織化學(xué)的口腔鱗癌表達更高。2002年，Beer等顯示HSP70在早期肺腺癌中過表達是1個不良預(yù)后的分子標(biāo)志物[7]。2003年，Kanazawa等認(rèn)為：大腸癌組織對HSP70和HSP40表現(xiàn)出特殊的免疫反應(yīng)性，分別為84%和14%[8]。卵巢癌細胞中HSP70的表達較正常卵巢細胞高幾倍[9]。HSP70也可能是早期肝細胞性肝癌的敏感指標(biāo)[10]。 Nylandsted等[11]首次發(fā)現(xiàn)了HSP70的損耗將導(dǎo)致乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤和肝癌等細胞系的死亡，并且HSP70的表達是人類癌細胞存活的先決條件。趙霞等[12]研究HSP70反義寡聚核苷酸阻斷Molt-4等腫瘤細胞的內(nèi)源性HSP70表達，發(fā)現(xiàn)HSP70反義寡聚核苷酸的使用可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖，說明HSP70的表達有助于腫瘤細胞的生存和增殖。

2.2 HSP70與腫瘤細胞凋亡

HSP70還參與了腫瘤細胞的凋亡，主要認(rèn)為HSP70是通過線粒體途徑和受體途徑來介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的。HSP70參與細胞凋亡的機制：①已知抑癌基因p53可促進凋亡的發(fā)生，當(dāng)染色體17 p等位基因缺失時可產(chǎn)生突變型p53蛋白，這種蛋白可抑制野生型p53蛋白而阻止凋亡的發(fā)生[13]，HSP70可通過阻止突變型p53蛋白的降解來阻止細胞的凋亡[14]；②應(yīng)激活化激酶JNK(C-JNK N-terminal k=inase)可以活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1來調(diào)節(jié)細胞的增殖、炎癥和凋亡，HSP70可以通過抑制JNK的去磷酸化來介導(dǎo)凋亡；③由于細胞色素C從線粒體中釋放出來后可與凋亡蛋白激酶活化因子1連接，在ATP/dATP依賴狀態(tài)下活化Caspase-9?；罨腃aspase具有活化自生酶原和Caspase-3的能力，故可放大Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，而且Caspase-9和Apaf-1的連接是Caspase級聯(lián)活化的關(guān)鍵，且兩者是通過的Caspase恢復(fù)結(jié)構(gòu)域CAPD連接在一起的。HSP70可通過與Caspase-9競爭Apaf-1的CARD結(jié)構(gòu)序列而導(dǎo)致Caspase-9的失活，從而影響細胞質(zhì)內(nèi)Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，抑制凋亡。HSP70對熱、電離輻射、氧化應(yīng)激等引起的凋亡具有保護作用。溫和熱處理和轉(zhuǎn)染HSP70基因誘導(dǎo)的HSP70表達與細胞對有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的細胞凋亡的抗性相關(guān)，HSP70的高表達可以對熱誘導(dǎo)的細胞凋亡起到抑制作用。Inchi等研究表明聯(lián)合使用非白血性白細胞病細胞衍生的HSP70與樹突狀細胞可通過誘導(dǎo)特異性細胞毒CD8+T細胞，從而安全有效地消除微量殘留白血病[15]。同時HSP70還可通過細胞凋亡機制促進腫瘤細胞的減滅，Aghdassi等用槲皮素去除HSP70在細胞凋亡中具有重要作用，選擇性去除HSP70可以用來誘導(dǎo)胰腺癌細胞的凋亡[16]。

2.3 HSP70與腫瘤免疫

在腫瘤細胞表面的HSP70可以引發(fā)針對該腫瘤細胞的特異性免疫，并與DC(樹突狀細胞)抗腫瘤作用有關(guān)[17]。腫瘤細胞自身呈遞抗原效率非常低下，原因在于腫瘤細胞MHC Ⅰ類分子往往低表達以及共同刺激分子缺乏。因此，具有腫瘤特異性的CD4+和CD8+淋巴細胞的激活必須依賴于抗原呈遞細胞的幫助，在由抗原呈遞細胞將內(nèi)源性抗原和外源性抗原，經(jīng)MHCⅠ類分子途徑和MHCⅡ類分子途徑，分別將抗原信息呈遞給CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞，通過自然殺傷(natural killer，NK)細胞發(fā)揮作用，同時激活輔助性T淋巴細胞釋放細胞因子，再經(jīng)細胞免疫途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用。

腫瘤的免疫主要是由T淋巴細胞介導(dǎo)的，而HSP70又與T淋巴細胞的增殖密切相關(guān)，可以促進它的增殖[18]。眾所周知，抗腫瘤的肽合成物經(jīng)由MHCⅠ類分子途徑與外源性抗原雜交可以誘導(dǎo)CD8+T淋巴細胞免疫，但是他們激活CD4+T淋巴細胞的作用機制并不是很清楚。直到近來的一些研究表明，HSP70能夠通過MHCⅡ類分子呈遞途徑，增強機體的特異性CD4+T細胞反應(yīng)[19]，而帶有HSP70復(fù)合物形成的抗原肽，在引發(fā)特定性抗原擴增的過程中是完全必要的。由此可以看出，HSP70不但可以增強特異性抗原CD4+T細胞的繁殖，而且還可以增強肽合成物在人類CD4+T細胞中的免疫原性。與普通細胞相比，腫瘤細胞內(nèi)含有選擇性的膜HSP70。這種腫瘤選擇性膜HSP70的表達已經(jīng)證實了與人類NK細胞介導(dǎo)的溶解的敏感性增強有關(guān)。單核細胞通過CD14依賴的信號通路分泌促炎癥反應(yīng)的細胞因子來適應(yīng)可溶性的HSP70蛋白，并且結(jié)合在細胞膜表面的HSP70作為1種由NK細胞介導(dǎo)的細胞溶解攻擊靶組織而被識別[20]。大量的實驗證明，HSP70的高表達有保護腫瘤細胞的作用，但也有實驗表明，在用帶有差異性膜HSP70表達模式的自體腫瘤亞系細胞中，HSP70高表達的惡性腫瘤細胞比HSP70低表達的惡性腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死。Gough MJ等[21]研究，經(jīng)過細胞凋亡作用的巨噬細胞可以使HSP70顯著地抑制IL-10的分泌和細胞碎片的吞噬作用。而單獨的巨噬細胞不能使HSP70產(chǎn)生免疫性刺激?？墒?，當(dāng)巨噬細胞在具有細胞殺傷能力的時候，HSP70就明顯扮演了激活巨噬細胞信號的關(guān)鍵分子。DC(樹狀突細胞)其表面存在HSP70 高親和力的CD91受體，而腫瘤細胞的抗原肽與HSP70結(jié)合可誘導(dǎo)DC成熟；而成熟的DC刺激未致敏的T細胞的能力增強，從而能夠誘發(fā)機體T淋巴細胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)，有效地殺傷腫瘤細胞[22，23]。而DC作為1種專職呈遞細胞，其呈遞能力最為強大，它能夠有效攝取、加工腫瘤抗原，再經(jīng)MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子途徑呈遞給T淋巴細胞和B淋巴細胞，使之激活，產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

2.4 HSP70與腫瘤的治療

腫瘤的治療有多種，目前主要有2種治療研究較多，一種是腫瘤的免疫治療，盡管現(xiàn)在可以針對許多種腫瘤產(chǎn)生針對性的抗腫瘤免疫，但大多數(shù)的腫瘤細胞在腫瘤表達的過程中會產(chǎn)生耐受的現(xiàn)象。這些耐受的現(xiàn)象包括很多機制，像腫瘤細胞T淋巴細胞的殺傷力的減弱，MHCⅠ類分子的調(diào)節(jié)低下、免疫監(jiān)視的逃脫和腫瘤抗原耐受性的增強等。Calderwood等[24]，認(rèn)為細胞外的HSP70是腫瘤免疫治療的有效試劑，它能夠阻斷腫瘤相關(guān)抗原耐受過程，并且通過細胞毒素CD8+T淋巴細胞殺傷特定的腫瘤細胞。FU等[25]將HSP70與白細胞介素2(IL-2)以不同的計量和時間間隔分別注入已移植出腫瘤的老鼠體內(nèi)，實驗結(jié)果表明HSP70比IL-2能更有效的抑制腫瘤的生長或者在不同程度上延長老鼠的壽命，而在兩者復(fù)合治療過程中HSP70在延長和消除腫瘤的作用中也起到了主要的作用。另一種是腫瘤的基因治療。基因治療的目的是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達的緊密間隙和時序控制，關(guān)于可誘導(dǎo)的基因啟動子在用于自殺基因的調(diào)控上有很多種途徑。Schmidt等[26]，在體外分別用頭、頸部2種穩(wěn)定的細胞株進行試驗，將2種啟動子分別作用于2種細胞株并且用熒光激活細胞分類技術(shù)、蛋白印跡分析技術(shù)和熒光顯微鏡檢查技術(shù)分析測量這2種因子對基因活化的作用。結(jié)果表明HSP70啟動子在2種細胞株中的1種，其基因活性是已報道基因表達活性的5.83倍。因此，HSP70啟動子為基因治療提供了1種有用的途徑。同時，熱誘導(dǎo)的HSP70啟動子用于基因治療的這個特性在體內(nèi)和體外等許多的腫瘤株中也得到了證實[27]。另外國內(nèi)也有文獻報道在胃癌、宮頸癌細胞中HSP70 mRNA大大增強的結(jié)果。為應(yīng)對這種變化，細胞就需要合成足夠量的HSP70。因此，其調(diào)控機制就促進HSP70基因大量合成mRNA，從而使HSP70呈現(xiàn)高表達。而高表達HSP70可以抑制腫瘤細胞死亡，使腫瘤細胞產(chǎn)生耐受，如果通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄可以減少HSP70表達,就可以有效地殺傷腫瘤細胞，從而就可以為腫瘤的基因治療提供1個新的途徑。

總之，HSP70作為分子伴侶的1種，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，與大部分惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡及預(yù)后關(guān)系密切，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。明確HSP70的調(diào)控機制及作用過程，將有利于腫瘤發(fā)病機制的闡明，并為腫瘤的診治提供更充分的理論依據(jù)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，HSP70將作為治療腫瘤的靶點，并以此為腫瘤治療設(shè)計新的抗癌藥物。HSP70反義RNA可阻斷腫瘤細胞HSP70的表達，阻止腫瘤細胞中蛋白的合成，抑制腫瘤細胞增生。腫瘤細胞中可提取可溶性HSP(主要是HSP90，HSP70及gp96)，制成HSP-PC疫苗，用于治療腫瘤，這些都為腫瘤的治療提供了1個新的思路，是我們研究的方向。

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