劉 蕾，王鈺涵，韓 光，張 瑜

（河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004）

穿心蓮有效部位Poloxamer188聚合物膠束的制備工藝

劉 蕾，王鈺涵，韓 光＊，張 瑜

（河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004）

目的制備Poloxamer188穿心蓮有效部位的聚合物膠束。方法薄膜水化法制備穿心蓮有效部位聚合物膠束，正交設(shè)計優(yōu)化處方工藝。HPLC法測定其載藥量和包封率，激光粒度儀測定粒徑。結(jié)果載藥膠束包封率為（85.7＋2.1）%，載藥量為（1.11＋0.09）%，粒徑為（198.32＋3.35）nm。結(jié)論載藥Poloxamer188膠束制備工藝簡便易行，為中藥制劑提供了新劑型。

穿心蓮有效部位；Poloxamer188；聚合物膠束

穿心蓮是我國治療肺部感染疾病的傳統(tǒng)中藥，早在兩千多年前，印度就有用穿心蓮治療肺部腫瘤的記載?，F(xiàn)代研究表明［1－4］，穿心蓮提取物及以穿心蓮內(nèi)酯為代表的二萜內(nèi)酯類成分具有廣譜的抗腫瘤活性。穿心蓮內(nèi)酯類化合物主要通過細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期G0／G1期、抑制新生血管的形成及免疫調(diào)節(jié)等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，從而被認(rèn)為是一類重要的抗腫瘤候選藥物［5－9］。穿心蓮多采用乙醇法提取。近年來葛發(fā)歡、范云鴿等［10－11］報道了超臨界CO2萃取和大孔吸附樹脂富集穿心蓮二萜內(nèi)酯類成分的新方法，2種方法均使穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量提高。

聚合物膠束是兩親性聚合物在水溶液中通過分子自組裝原理形成的粒徑均一、具有核殼結(jié)構(gòu)的微粒，通過將難溶性抗腫瘤藥物包載于膠束的疏水內(nèi)核實現(xiàn)增加溶解度和腫瘤靶向性的目的，作為一種新型的藥物傳輸系統(tǒng)日益引起人們關(guān)注［12－13］。

Poloxamer是目前最常用的聚合物膠束制劑材料之一，其結(jié)構(gòu)為聚氧乙烯－聚氧丙烯－聚氧乙烯（PEO－PPO－PEO）三嵌段共聚物，可在水溶液中自發(fā)形成膠束。疏水嵌段PPO形成內(nèi)核，PEO嵌段環(huán)繞在外形成外殼，不僅能增溶難溶性藥物，還具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的作用［14］。

我們以Poloxamer188為載體材料，采用薄膜水化法制備穿心蓮有效部位膠束。以有效部位中主要有效成分穿心蓮內(nèi)酯的包封率、載藥量和粒徑為評價指標(biāo)，通過正交設(shè)計法優(yōu)化得到最佳處方和制備工藝。

1 材料

1.1 藥品和試劑

泊洛沙姆188（Pluronic F68，BASF）；穿心蓮有效部位（自制，HPLC法測定含量，其中含穿心蓮內(nèi)酯40.56%，脫水穿心蓮內(nèi)酯10.89%，14－去氧穿心蓮內(nèi)酯5.83%）；對照品穿心蓮內(nèi)酯（中國藥品生物制品檢定所）。甲醇（CR，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；乙腈（CR，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

1.2 儀器

KQ－5200DA型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE2000（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ－ⅢB循環(huán)水真空泵（上海儀表供應(yīng)公司）；日本島津 LC－2010高效液相色譜儀（SEDEX蒸發(fā)光散射檢測器，CLASS－VP色譜工作站）；ZetasizerH－3000激光粒度測定儀 （英國馬爾文公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮有效部位聚合物膠束的制備

稱取處方量的Poloxamer 188和穿心蓮有效部位于250mL圓底燒瓶中，加入12mL甲醇，超聲使之完全溶解成為透明均一的溶液。于一定溫度和壓力下旋蒸去溶劑，在瓶壁上形成較為均勻的干燥薄膜。加入適量緩沖溶液，輕輕振蕩使膜溶入其中。以保鮮膜封口，室溫放置4h以上。0.22μm微孔濾膜過濾，得透明均一的淺黃色膠束溶液。

2.2 單因素考察

其他條件固定的情況下，改變單一因素（投料比、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度、水化溫度、水化時水相用量、水化pH），以包封率為主要考察指標(biāo)來考察其處方和工藝。

2.2.1 投藥量的影響 固定載體量為120mg，水化溶液量為7.5mL，考察投藥量為6、8、10、12、15mg時包封率的變化。結(jié)果顯示：在不同投藥量時，其包封 率 依 次 為 58.6%、66.7%、88.1%、94.4%、77.3%。表明：隨著投藥量的增加，包封率增加，當(dāng)投藥量為12mg時達(dá)到最大值，后又開始下降。

2.2.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度的影響 固定載體量為120mg，投藥量為12mg，考察旋蒸溫度為40、50、60、70℃時包封率的變化。結(jié)果顯示：在不同旋蒸溫度下，其包封率依次為24.7%、40.7%、68.8%、69.3%。表明：隨旋蒸溫度升高，包封率增加，70℃時達(dá)到最高。

2.2.3 水化溫度的影響 固定載體量120mg，投藥量為12mg，在70℃下蒸去溶劑，水化體積為7.5mL，考察水化溫度為4、35、50℃時包封率的變化。結(jié)果顯示：在不同水化溫度下，其包封率依次為75.7%、83.5%、69.4%。表明：隨著水化溫度升高，包封率增加，35℃時最高為83.5%，溫度繼續(xù)升高，包封率反而降低，總體來看影響不顯著。

2.2.4 水化用量的影響 固定載體量120mg，投藥量為12mg，在70℃下蒸去溶劑，考察水化體積各為6、7、8、9、10mL在室溫下水化的包封率變化。結(jié)果顯示：在不同水化用量下，其包封率依次為64.4%、88.7%、70.1%、36.7%、73.6%。表明：隨著水化用量增加，包封率增加，繼續(xù)增加用量，包封率降低后又有增加，變化呈波浪式，其中水化體積7mL，包封率最大。

2.2.5 水化pH的影響 固定載體量120mg，投藥量為12mg，在70℃下蒸去溶劑，考察水相緩沖溶液在pH7.29、6.48、5.04條件下室溫水化的包封率變化。結(jié)果顯示：在不同水化用量下，其包封率依次為63.2%、51.3%、54.6%。表明：隨著水化pH 值的增加，包封率變化不大。

結(jié)果表明：投藥量、旋蒸溫度、水相用量對藥物的包封率有顯著的影響，故而將這3個因素取適當(dāng)水平進(jìn)一步優(yōu)化處方工藝。水化溫度對包封率的影響波度較小，結(jié)合實驗操作的實際情況，選擇各個因素水平均置室溫下水化。水相pH對包封率影響亦不大，結(jié)合藥物性狀和應(yīng)用最終選擇pH7.2的緩沖溶液。

2.3 正交設(shè)計

選擇對膠束形成有顯著影響的3個因素：投料比（A），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度（B），水相用量（C），每個因素選擇3個水平，采用L9（33）正交表進(jìn)行試驗。因素與水平見表1。以包封率為考察指標(biāo)優(yōu)化處方工藝，試驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

從分析結(jié)果可以看出，包封率的影響程度分別依次為A＞C＞B，即投藥量對穿心蓮有效部位膠束的包封率有十分顯著的影響，水化用量的影響較小，旋蒸溫度的影響不顯著。穿心蓮超分子的最佳因素水平組合為A3B1C1。綜合考慮，投藥15mg，于50℃下成膜，水相用量為7mL時，為聚合物膠束的最佳制備條件。

2.4 驗證試驗

按優(yōu)化處方制備3批穿心蓮有效部位聚合物膠束，測定包封率和載藥量，結(jié)果見表3，包封率為（85.7＋2.1）%，載藥量為 （1.11＋0.09）%。所得包封率和載藥量均在理論預(yù)測范圍內(nèi)，表明優(yōu)化處方重現(xiàn)性良好。

表3 優(yōu)化條件的驗證結(jié)果（n＝3）

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的配制 精密稱取對照品穿心蓮內(nèi)酯12mg，加甲醇適量，超聲使溶解，冷卻至室溫后加甲醇定容至10mL。

2.5.2 色譜條件 色譜柱：Agliendt－ZORBAX Extent－C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈－水（30：70）；流速：1.0mL／min；柱溫：室溫，理論塔板數(shù)以穿心蓮內(nèi)酯計不低于6000。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液稀釋10倍，分別進(jìn)樣2、4、8、10、15、20μL各2針，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y＝659884 X－596486（r＝0.9994）。結(jié)果表明：穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.24～2.4μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.4 精密度試驗 取穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計算日內(nèi)精密度為0.9%；連續(xù)測定5d，計算日間精密度為1.0%。結(jié)果表明精密度良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 按處方量的80%、100%、120%稱取穿心蓮有效部位適量，分別加處方比例的輔料，以甲醇溶解成為穿心蓮內(nèi)酯含量為0.48、0.60、0.72mg／mL的樣品溶液，測定并計算得出穿心蓮內(nèi)酯的平均加樣回收率為93.4%。該法的專屬性、精密度及回收率均符合方法學(xué)要求。

2.6 包封率和載藥量

采用微孔濾膜法測定。精密移取經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾的載藥膠束溶液50μL，置于10mL容量瓶中，用流動相將樣品稀釋刻度，混勻，在“2.5.2”項下色譜條件測定穿心蓮內(nèi)酯的含量，根據(jù)以下公式計算包封率和載藥量：包封率（EE%）＝ Wi／Wt×100%，載藥量（DL%）＝ Wi／（Wi＋ Wc）×100%，其中Wt為投藥量，Wi為膠束中被包封的藥物量，Wc為poloxamer188的質(zhì)量。

2.7 粒徑測定

所得的膠束溶液無色透明。激光粒度儀測得其平均粒徑為（198.32＋3.35）nm。

3 討論

以poloxamer188為載體材料，考察了注入法和薄膜水化法。結(jié)果表明，2種方法膠束包封率、載藥量相似，但因注入法周期較長，不同人員操作時會帶來一定的差異。故選擇了制備工藝簡單、周期短的薄膜水化法來制備載藥聚合物膠束。

在膠束的制備過程中，單因素考察實驗結(jié)果表明，影響穿心蓮有效部位膠束包封率的主要因素有三個：投藥量、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度和水化體積。故可采用三因素三水平的正交設(shè)計表做處方優(yōu)化。優(yōu)化的制備條件重現(xiàn)性好，包封率為（85.7＋2.1）%，載藥量為（1.11＋0.09）%，膠束溶液的濃度為（1.6＋0.05）mg／mL，其中穿心蓮內(nèi)酯的有效濃度為（0.64＋0.02）mg／mL。盡管有效部位主要包含穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和14－去氧穿心蓮內(nèi)酯3種有效成分，但因其中穿心蓮內(nèi)酯的含量高達(dá)40.56%，故而選取以穿心蓮內(nèi)酯的包封率為主要指標(biāo)對載藥膠束制備工藝進(jìn)行評價。對其粒徑考察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)均在190nm左右。究其原因，認(rèn)為是增大載藥量，膠束會容易聚集，粒徑隨之增大［15］，而且作為中藥制劑，成分較為復(fù)雜，故粒徑較大。

4 結(jié)論

選擇載藥量較高、制備工藝簡單的薄膜水化法制備穿心蓮有效部位的poloxamer188膠束，以包封率、載藥量和粒徑為主要考察指標(biāo)，單因素考察投藥量、水相用量等影響因素。在此基礎(chǔ)上，正交設(shè)計優(yōu)化膠束處方工藝，選用投藥量、水相用量、蒸發(fā)溫度為考察因素，最終確定的優(yōu)化處方為：穿心蓮有效部位15mg，poloxamer188120mg，水相用量7mL，于50℃下成膜。使穿心蓮有效部位在水溶液中的濃度達(dá)到1.61mg／mL。重復(fù)實驗證明，結(jié)果有較高的可靠性。而且本實驗的制備工藝簡便易行，為中藥制劑提供了新劑型。

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［責(zé)任編輯 段金卯］

Preparation and formulation of poloxamer188 loaded effective parts of andrographis paniculata nees polymeric micelles

LIU Lei，WANG Yu－h(huán)an，HAN Guang＊，ZHANG Yu（Institute of Pharmaceutics of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

ObjectiveTo prepare the capsule of poloxamer188polymeric micelles system loaded with effective parts of andrographis paniculata nees （AEP）.MethodsAEP loaded Poloxamer188micelles were prepared by thin－film hydration method.The main factors affecting the drug－loading encapsulation ratio was studied by single factor analysis and optimization preparation condition was gained by orthogonal design.The drug－loading coefficient and encapsulation efficiency of AEP in micelles were determined by HPLC.The mean particle size was determined by ZetasizerH－3000 Laser Particle Size Analyzer.ResultsThe encapsulation efficiency and drug－loading coefficient were（85.7＋2.1）%and（1.11＋0.09）%，respectively.The diameter was（198.32＋3.35）nm.ConclusionThe process is practical and simple for the preparation of AEP loaded Poloxamer188micelles.It is a new method for the preparation of Chinese Traditional Medicine.

Effective parts of Andrographis paniculata Nees（AEP）；Poloxamer188；Polymeric micelles

R283

A

1672－7606（2012）02－0091－04

2012－02－23

河南大學(xué)科研基金項目（2009ZZZD006）。

劉蕾（1977－），女，河南南陽人，講師，從事天然藥物化學(xué)的教學(xué)和研究工作。

＊通訊作者：韓光（1966－），女，北京人，教授，從事天然藥物化學(xué)的教學(xué)和研究工作。