王紅鋼，林 波，汪文利

（1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 開封 475004；2.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，河南 開封 475004；3.開封市第二人民醫(yī)院 耳鼻喉科，河南 開封 475000）

不同轉(zhuǎn)染條件影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的探討

王紅鋼1，林 波2，汪文利3

（1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 開封 475004；2.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，河南 開封 475004；3.開封市第二人民醫(yī)院 耳鼻喉科，河南 開封 475000）

目的通過插入不同片段質(zhì)粒、不同劑量的轉(zhuǎn)染，研究GFP基因轉(zhuǎn)染效率的變化。方法構(gòu)建插入不同片段的載體，以不同條件轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以Northern blot分別檢測轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中各個(gè)質(zhì)粒的表達(dá)水平。結(jié)果2.0×105／mL細(xì)胞濃度的轉(zhuǎn)染效率高于1.0×105／mL細(xì)胞濃度；固定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和脂質(zhì)體的比值，轉(zhuǎn)染效率隨轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的上升而增加；固定脂質(zhì)體的量，C1－ORF2、C1－ORF2as和C1－280－1×14as隨轉(zhuǎn)染劑量的增加，轉(zhuǎn)染效率先升高再下降或表現(xiàn)持平。結(jié)論轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的種類、劑量及轉(zhuǎn)染細(xì)胞濃度影響轉(zhuǎn)染質(zhì)粒報(bào)告基因表達(dá)。

轉(zhuǎn)染；質(zhì)粒；脂質(zhì)體；Northern blot；GFP

目前，研究基因表達(dá)的常用方法是將外源基因轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞，病毒和非病毒載體是常用的兩種載體［1－2］。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但其具有公共安全性和較易產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性等問題［3－4］。非病毒載體免疫性低，能進(jìn)行多次注射和大批生產(chǎn)，對于臨床基因治療擁有很大的應(yīng)用潛力。常用的非病毒載體轉(zhuǎn)基因方法有電穿孔法、磷酸鈣沉淀法和脂質(zhì)體法［4－7］。LipofectamineTM2000容易優(yōu)化和操作，在有血清存在的條件下仍然能保持較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，可用于多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒經(jīng)載體導(dǎo)入細(xì)胞之后，其表達(dá)還受質(zhì)粒大小、轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的量、細(xì)胞類型、啟動子／增強(qiáng)子類型等條件的影響。本研究用不同插入片段的質(zhì)粒，以不同的質(zhì)粒量轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，檢測對GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響。

1 資料和方法

1.1 材料

pAlu14質(zhì)粒為本研究室前期工作構(gòu)建，系將14個(gè)Alu元件同向、正向串連插入pEGFP－C1質(zhì)粒的GFP基因下游，pEGFP－C1質(zhì)粒為空載體，不含有插入序列。pEGFP－C1質(zhì)粒、DH5α菌株和HeLa細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 合成22R或其帶有突變位點(diǎn)的模板序列，用帶有酶切位點(diǎn)引物PCR擴(kuò)增合成的模板，引入酶切位點(diǎn)。將突變序列插入pEGFPC1質(zhì)粒，利用XbaⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)可以用T4 DNA連接酶連接，但是連接以后對2種酶均不敏感的特性，制成帶有22R突變序列的2串聯(lián)質(zhì)粒，將突變的插入序列切下連入C1－Alu14質(zhì)粒（pEGFP－C1－Alu14）的GFP基因和Alu串聯(lián)序列之間，測序正確后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活新生小牛血清并加入DMEM培養(yǎng)液中（含青霉素100U／mL、鏈霉素100mg／L），放置于37℃溫箱培養(yǎng)。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化，培養(yǎng)瓶溫箱培養(yǎng)3d，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 不同類型和量的質(zhì)粒（包括重組表達(dá)載體和pEGFP－C1）用LipofectamineTM2000（Invitrogen Carlsbad，USA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24孔板的HeLa細(xì)胞，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)36h，用Trizol試劑提取總RNA用于Northern blot檢測。

1.2.4 Northern blot檢測 用9N隨機(jī)引物和大腸桿菌DNA聚合酶大片段將α－32P－dCTP摻入DNA（590bp）中制備GFP基因探針。上、下游引物分別為：5′－CTTGTACAGCTCGTCCATGC－3′和5′－CTTGTACAGCTCGTCCATGC－3′。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與探針雜交后放射自顯影。用剝離液處理雜交過的尼龍膜，去除GFP基因探針，用檢測Neo RNA探針再次雜交，放射自顯影作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參照。Neo探針用隨機(jī)引物法標(biāo)記，擴(kuò)增片段為671bp，上、下 游 引 物 分 別 為：5′－CACAACAGA CAATCGGCTGCT－3′ 和 5′－AGCGGCGATACCG TAAAGCAC－3′。

2 結(jié)果

2.1 HeLa細(xì)胞濃度對GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響

將HeLa細(xì)胞用胰酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基配成1.0×105／mL和2.0×105／mL，加入12孔培養(yǎng)板中，1.0mL／孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)24h，用以下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：C1－1A×2－Alu14（1A），C1－22R×2－Alu14（22R），C1－Alu14（Alu14），C1－1AMI×2－Alu14（1AMI），C1－4TMI×2Alu14（4TMI），轉(zhuǎn)染量均為0.8μg質(zhì)粒／4μL脂質(zhì)體／孔。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h或36h，提取RNA做Northern印記檢測GFP RNA的表達(dá)，結(jié)果見圖1。1A，22R，Alu14不同的細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h，結(jié)果說明，2.0×105／mL細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)染效率高于1.0×105／mL細(xì)胞濃度（圖1泳道1比較泳道2，泳道3比較泳道4，泳道5比較泳道6）。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)36h的結(jié)果與培養(yǎng)24h的結(jié)果類似（圖1泳道7比較泳道8，泳道11比較泳道12，泳道15比較泳道16）。1AMI和4TMI 2個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)36h的結(jié)果說明，2.0×105／mL細(xì)胞濃度的轉(zhuǎn)染效率高于1.0×105／mL細(xì)胞濃度（圖1泳道9比較泳道10，泳道13比較泳道14）。

圖1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞濃度對GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對GFP基因表達(dá)的影響

用不同量的質(zhì)粒－脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物（質(zhì)粒量∶脂質(zhì)體體積＝1∶2），轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞（1.8×105細(xì)胞／孔）。質(zhì)粒－脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量如下：0.5μg質(zhì)粒／1.0μL脂質(zhì)體／50μL，1.0μg質(zhì)粒／2.0μL脂質(zhì)體／100μL，2.0μg質(zhì)粒／4.0μL脂質(zhì)體／200μL，3.0μg質(zhì)粒／6.0μL脂質(zhì)體／300μL。4種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，均隨著質(zhì)粒－脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的上升而上升，結(jié)果見圖2。圖2A是C1－Alu14、C1－7nt×16質(zhì)粒（本室以往工作構(gòu)建，AAATAAA反復(fù)重復(fù)共640bp）的轉(zhuǎn)染結(jié)果。圖2B是C1－280－1×14、pEGFP－C1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果。

圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對GFP基因表達(dá)的影響

2.3 不同質(zhì)粒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對GFP基因表達(dá)產(chǎn)生影響

對恒定轉(zhuǎn)染復(fù)合物的體積，恒定脂質(zhì)體的量，改變質(zhì)粒的量對轉(zhuǎn)染效率的影響，本研究用不同質(zhì)粒做了觀察。C1－ORF2，pEGFP－C1，C1－Ag×16（本室以往工作構(gòu)建，AgAgAgAg反復(fù)重復(fù)共640bp），C1－PolyAas－Alu14，C1－PolyAas－ORF2，C1－2F2R×64和C1－2A2C×16共7個(gè)插入不同DNA片段的質(zhì)粒，按不同質(zhì)粒量轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，結(jié)果見圖3。質(zhì)粒的量對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響的總趨勢是：轉(zhuǎn)染效率隨轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量的增加而上升，但是，對于不同的質(zhì)粒上升的幅度不完全一致。pEGFP－C1，C1－2F2R×64和 C1－2A2C×16這3種質(zhì)粒屬于轉(zhuǎn)染量明顯影響轉(zhuǎn)染效率的質(zhì)粒（圖3B、F、G）；圖3C、D、E是C1－Ag×16，C1－PolyAas－Alu14，C1－PolyAas－ORF23種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果，質(zhì)粒0.4μg轉(zhuǎn)染與0.8μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，GFP基因表達(dá)上升不如上述的粒明顯；C1－ORF2轉(zhuǎn)染量在0.8μg時(shí)GFP基因表達(dá)持平或略高于1.2μg（圖3A）。

圖3 不同質(zhì)粒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對GFP基因表達(dá)產(chǎn)生不同影響

2.4 轉(zhuǎn)染量在不同的質(zhì)粒影響GFP報(bào)告基因表達(dá)

圖3中C1－ORF2轉(zhuǎn)染量在0.8μg時(shí)GFP基因表達(dá)持平或略高于1.2μg。為了驗(yàn)證該現(xiàn)象，用C1－ORF2，C1－ORF2as和 C1－Alu143種質(zhì)粒做類似實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4A。C1－ORF2和C1－ORF2as的表現(xiàn)與C1－Alu14不同（泳道1～6比較泳道7～9），C1－Alu14質(zhì)粒隨著轉(zhuǎn)染量的上升，GFP基因表達(dá)明顯提高，而C1－ORF2和C1－ORF2as質(zhì)粒的GFP基因表達(dá)在0.8μg之后提高不顯著甚至有下降的趨勢。圖4B 用 C1－Alu14as，C1－280－1×14 和 C1－280－1×14as做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，C1－280－1×14as質(zhì)粒在0.8μg質(zhì)粒量時(shí)，GFP基因表達(dá)比0.4μg質(zhì)粒的GFP基因表達(dá)明顯升高，但是1.2μg質(zhì)粒量比0.8μg質(zhì)粒量的GFP基因表達(dá)升高不明顯或有下降趨勢（圖4B泳道7～9）；C1－Alu14as隨著質(zhì)粒量的增加呈持續(xù)上升，與圖4A中C1－Alu14的結(jié)果類似。

圖4 轉(zhuǎn)染量在不同的質(zhì)粒影響GFP報(bào)告基因表達(dá)

3 討論

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量影響其基因表達(dá)在國內(nèi)外均有報(bào)道［5－6］。轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒的量影響轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)每孔質(zhì)粒為0.5μg時(shí)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染效率最高。質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例影響轉(zhuǎn)染效率，DNA和LipofectamineTM2000比例為1∶3時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，約72%［7］。

質(zhì)粒大小也影響其轉(zhuǎn)染效率，將λ噬菌體不同大小的 DNA 片段（0.65、1.20、2.40、2.90、5.00kb）插入pGL3－c質(zhì)粒的熒光素酶報(bào)告基因下游，隨著插入片段長度的增加，報(bào)告基因表達(dá)降低［8］。本研究使用的表達(dá)載體為pEGFP－C1，在GFP基因下游插入不同基因片段，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，研究GFP基因表達(dá)與上述插入有不同片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的關(guān)系。結(jié)果表明，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率在一定的范圍內(nèi)與其轉(zhuǎn)染量呈正相關(guān)，0.4μg的C1－ORF2轉(zhuǎn)染時(shí)，GFP基因幾乎不表達(dá)，當(dāng)0.8μg轉(zhuǎn)染時(shí)，GFP基因表達(dá)迅速上升。但是在1.2μg轉(zhuǎn)染時(shí)，GFP基因表達(dá)反而下降（圖 3A），C1－ORF2as（圖 4A），C1－280－1×14as（圖4B）也有類似表現(xiàn)。

將H2－Kb基因轉(zhuǎn)入到C57小鼠中檢測其表達(dá)，結(jié)果表明，基因表達(dá)不與轉(zhuǎn)基因的個(gè)數(shù)完全呈正比［9］，轉(zhuǎn)入13個(gè)基因的小鼠淋巴結(jié)表達(dá)值為7.2，而轉(zhuǎn)入39個(gè)基因的表達(dá)僅為3.4。用PAC報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，同時(shí)用無關(guān)質(zhì)粒如pUC18進(jìn)行稀釋（相當(dāng)于減少報(bào)告質(zhì)粒的量），結(jié)果顯示，在某些稀釋倍數(shù)時(shí)，PAC質(zhì)粒的表達(dá)不下降反而上升［10］，我們也得到了相似結(jié)果，為什么出現(xiàn)此現(xiàn)象，還不能很好的解釋，是否與等位基因排斥有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

［1］Cavazzana－calvo M，Thrashier A，Mavilio F.The future of gene therapy［J］.Nature，2004，427（6977）：779－781.

［2］Anderson W F.Human gene therapy［J］.Nature，1998，392（6679）：25－30.

［3］Shubiao Z，Yingmei X，Bing W，et al.Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery［J］.Journal of Controlled Release，2004，100（2）：165－180.

［4］Ma B，Zhang S，Jiang H，et al.Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery［J］.J Control Release，2007，123（3）：184－194.

［5］許期年，王秀云，左劍玲，等.3種脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的比較研究［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（4）：2119－2122.

［6］Zabner J，F(xiàn)asbender A J，Moninger T，et al.Cellular andmolecular Barriers to Gene Transfer by a Cationic Lipid［J］.J Biomol Bio，1995，270（32）：18997－19007.

［7］段艷，王冰，崔韶輝，等.陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（11）：2119－2122.

［8］Yin W，Xiang P，Li Q.Investigations of the effect of DNA size in transient transfection assay using dual luciferase system ［J］.Analytical Biochemistry，2005，346（2）：289－294.

［9］Hatinaa J，F(xiàn)rangoulisc B，Gregorova S，et al.Lymphoid speci city of a copy number－related expression of the H2－Kb transgene［J］.Molecular Immunology，1999，36（1）：73－80.

［10］Walker W E，Porteous D J，Boyd A C.The effects of plasmid copy number and sequence context upon transfection efficiency［J］.J Control Release，2004，94（1）：245－252.

［責(zé)任編輯 時(shí) 紅］

Study for the influence of different transfected condition on plasmid transfected efficiency

WANG Hong－gang1，LIN Bo2，WANG Wen－li 3（1.Department of Biochemistry and molecular Biology，Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Dept.of Pathology and Pathophysiology，Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；3.Otolaryngological Dept.of Kaifeng Second People Hospital，Kaifeng，Henan 475000，China）

ObjectiveTo study the change of the transfected efferency of GFP gene by transfecting plasmids inserted different segments with different amounts.MethodsThe plasmids inserted different segments were constructed and transfected into HeLa cells with different transfected condition，Northern blot then was used to detect the expression of the transfected plasmids respectively.ResultsThe transfected efficiency of the cell concention of 2.0×105／mL was higher than that of the cell concention of 1.0×105／mL；When the ratio between the plasmid and the lipofectamine was kept constantly，the transfected efficiency increased with the amount of the transfected compound increase.When the amount of lipofectamine was constantly，the transfected efficiency of C1－ORF2，C1－ORF2as，and C1－280－1×14as firstly increased then decreased or kept fair with the transfected amount increased.ConclusionThetype and amount of transfected plasmids and the concentration of transfected cells influenced the expression of transfected plasmids.

Transfection；Plasmid；Lipofectamine；Northern blot；GFP

Q782

A

1672－7606（2012）02－0111－04

2011－12－12

王紅鋼（1975－），男，河南 開封 人，博士，副教授，從事基因表達(dá)調(diào)節(jié)的研究工作。