王明珠，徐 斐，曹 慧，于勁松

（上海理工大學食品質(zhì)量與安全研究所，上海 200093）

0 引言

當前，農(nóng)藥的濫用對人類健康和環(huán)境產(chǎn)生很大威脅，傳統(tǒng)的氣相液相色譜檢測方法準確可靠，適用于各種溶液的樣品，不足之處在于檢測設備昂貴、程序復雜、響應時間長、專業(yè)技術性強、檢測成本高等。隨著現(xiàn)代分析化學和微電子技術的提高，農(nóng)藥殘留快速檢測技術得到迅速的發(fā)展，酶生物傳感器作為一種可以實時在線監(jiān)測農(nóng)殘量的儀器具有較大的研究價值。

目前，對酶生物傳感器的研究已較為廣泛，信號轉(zhuǎn)換元件已發(fā)展成熟，但生物敏感元件的選擇性、靈敏度、檢測限、穩(wěn)定性、響應時間以及可重復性等仍影響著生物傳感器的市場化應用，所以，達到實用化階段的產(chǎn)品還較少［1］。本文針對酶生物傳感器中使用較廣泛的酶的種類、酶的固定化技術以及酶生物傳感器在實際樣品檢測中的障礙和發(fā)展趨勢做一概述，以便為后續(xù)研究提供參考。

1 檢測用酶的種類

1.1 膽堿酯酶

膽堿酯酶（Cholinesterase，ChE）是檢測有機磷類農(nóng)藥（organophosphate insecticides，OPs）廣泛使用的酶，依其催化底物的特異性分為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），ChE對有機磷的檢測是基于酶抑制原理。OPs使ChE磷酰化后降低了ChE催化底物的活性，通過比較有無OPs時酶催化底物水解的反應速率得到OPs對酶的抑制率，抑制率與OPs的濃度成一一對應關系，從而可以測得OPs的有無和濃度大小。

國內(nèi)外學者在ChE篩選方面做過大量工作，實驗表明:AChE和BChE對不同農(nóng)藥的檢測限是不一樣的［2］，此外，不同來源的同一種酶對農(nóng)藥的檢測限也不同，余孝穎等人比較了家蠅、電鰩和雞肝AChE對敵敵畏的檢測限，表明家蠅 AChE 對敵敵畏的檢測限最低，在1.1 ×10－7以下［3］，但家蠅的飼養(yǎng)困難，材料的獲得受到限制。另有文獻報道［4～6］，用肝臟組織和血清已經(jīng)成功提取純化出較高比活力的ChE，固定后對對氧磷和克百威的檢測限分別為1.65 × 10－10和4.68 ×10－11。鑒于從動物肝臟和血清中提取ChE簡便、快速、活力回收高、原材料豐富，是目前為止酶生物傳感器中應用最廣的ChE酶源。

除了動物來源的ChE外，紀淑娟等人從植物—豬腰豆幼苗中提取的AChE對敵敵畏、氧化樂果、滅多威的檢測限均低于國標規(guī)定的允許殘留限量，可以滿足農(nóng)藥殘留快速檢測的要求［7］，目前，對其他植物ChE在生物傳感器中的利用正在研發(fā)中。

綜上所述，ChE用于檢測OPs有諸多優(yōu)點，如，來源廣泛、便于提取、檢測靈敏度高，檢測限甚至能達到10－11，但是基于受農(nóng)藥抑制的酶為基礎做成的生物傳感器其固有缺點是:1）操作程序繁瑣，需要預抑制時間;2）特異性較差，干擾信號多;3）不可逆抑制使酶活喪失嚴重。

1.2 有機磷水解酶

另外一種較常用的酶是有機磷水解酶（organophorus hydrolase，OPH），其檢測原理是OPH能以OPs為底物催化水解其中的 P—O，P—F，P—S，P—CN 鍵產(chǎn)生酸和醇，從而導致反應體系中pH的變化，這種變化可以被轉(zhuǎn)換成可測量的電或光信號，實現(xiàn)OPs濃度的測定。

OPH廣泛分布于哺乳動物、昆蟲和微生物體內(nèi)，和ChE一樣，來源于不同生物和同一生物不同組織的OPH水解OPs的種類和能力是不同的，其中微生物體內(nèi)的OPH活性報道較多，國內(nèi)外學者已從多種細菌、藻類、霉菌中分離篩選出OPH［8］，但由于OPH是胞內(nèi)酶，提取技術尚不成熟，目前使用的OPH多提取自天然畢赤酵母菌株，但天然菌株中含量太低，生產(chǎn)成本高，這也是導致用OPH檢測OPs研發(fā)較晚和進展緩慢的重要原因［9］。

以OPH為檢測用酶做成的電流型傳感器反映的是各種OPs的信號［10］，而電位型傳感器僅反映能產(chǎn)生對硝基酚的OPs，Sch?ning M J據(jù)此原理設計的電流—電位型傳感器可實現(xiàn)兩類農(nóng)藥的區(qū)別檢測，檢測限在10×10－7級，為農(nóng)藥多殘留檢測提供了新的思路［11］。

OPH的優(yōu)點是分析物本身即作為底物參與反應，不需要預抑制時間;只水解OPs，選擇性強;檢測中酶活損失少，可重復利用。缺點是OPH檢測靈敏度普遍比ChE低，儀器核心芯片制作復雜，裝置生產(chǎn)成本較高，且在天然畢赤酵母菌株中含量太低。

1.3 基因改造酶

前文介紹的2種常用酶應用于生物傳感器上存在一定缺陷，比如:存在擴散阻礙、選擇性低、對環(huán)境敏感、靈敏度低、檢測限高、生產(chǎn)成本高等。為改善這些缺陷，近年利用基因工程技術生產(chǎn)較理想的新型生物酶成為研究熱點。通過堿基替換、插入、剪切以及組合突變等方法［12～15］，已篩選出具有有機溶劑耐受性、選擇性強等優(yōu)勢的ChE，此外，將OPH基因?qū)胛⑸矬w內(nèi)并胞外表達得到的OPH也成功應用在酶傳感器中［16］，大大降低了OPH的生產(chǎn)成本。

1.4 其他酶類

除上述提到的2種較常用的酶之外，還有一些酶類由于能被農(nóng)藥抑制而應用于酶傳感器中，如，酪氨酸酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、乙酰乳酸合酶、乙醇脫氫酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶［17～23］等。本文［24］比較了不同濃度的幾種農(nóng)藥對商品AChE和自制雞肝酶中總酯酶活力的抑制情況。結果表明:雞肝中多功能氧化酶的存在使其具有更低的農(nóng)藥含量檢出限，靈敏度與AChE接近且來源廣泛、提取簡便、價格低廉，是一種優(yōu)良的農(nóng)藥檢測用酶。

2 酶生物傳感器中酶的固定化技術

酶生物傳感器最主要的元件是固定化酶，因此，除了酶本身的性質(zhì)外，酶的固定化技術一直是生物傳感器研究的關鍵環(huán)節(jié)。它既要保持酶的固有特性，又要避免其應用上的缺陷。固定方法主要有以下幾種:

2.1 交聯(lián)固定法

交聯(lián)法結合牢固，應用較多，交聯(lián)劑使用最多的是戊二醛，實驗表明:戊二醛熏蒸法與浸泡法相比得到的固定化酶膜較薄，且酶膜越薄，對農(nóng)藥的敏感度越高，檢測限越低［25］。除戊二醛外，目前還有采用丙烯晴、聚乙二醇、雙醛淀粉［26］等末端有功能集團的長鏈做交聯(lián)劑的研究，這種柔性的交聯(lián)劑可以減少酶在固定化過程中因剛性碰撞導致的失活，且提高了酶的固定化速度。

近年來有大量實驗研究將AChE、有機磷水解酶、酪氨酸酶［10，18，27］等以戊二醛為交聯(lián)劑固定在新型載體—納米材料修飾的電極上，納米材料具有良好的生物兼容性且活性極高，可以有效地促進酶和電極之間的電子傳遞［28］，大幅降低氧化還原反應的過電位，納米材料以其獨特的優(yōu)勢已成為酶生物傳感器領域的研究熱點。

2.2 包埋法

包埋法突出的優(yōu)點是酶分子未發(fā)生化學反應，活力保持較高，且由于基質(zhì)的保護作用，固定化酶的儲存期較長，Andreescu S的實驗結果表明:溶膠—凝膠法包埋AChE在－20℃可保存6個月，聚乙烯醇—苯乙烯吡啶包埋酶在4℃可穩(wěn)定保存8個月。但凝膠網(wǎng)絡形成的擴散阻力較大，只有小分子的底物和產(chǎn)物可以通過。適當控制包埋條件可減小這種擴散抑制，Sotiropoulou S等人［29］通過傅里葉變換紅外光譜法和電化學阻抗光譜分析了AChE在溶膠凝膠中的流動機理，發(fā)現(xiàn)正硅酸乙酯與水混合比為1∶0.5時，固定酶膜疏水性最強，此條件下固定酶穩(wěn)定性好、泄漏少、活性幾乎沒有損失，對底物響應只需約30 s，對敵敵畏檢測靈敏度大大高于其他溶膠—凝膠固定酶制備的EBS。

2.3 結合使用法

為克服單一固定化方法的缺點，常采用2種或多種技術結合的方法，如吸附—包埋、吸附—交聯(lián)、包埋—共價結合、共價—交聯(lián)［30～32］等。Chough S H［33］先將 OPH 和牛血清白蛋白吸附于尼龍網(wǎng)上，再使用戊二醛熏蒸將酶與載體通過化學鍵連接，得到的固定化酶酶活保留率高且結合牢固，性質(zhì)穩(wěn)定。近年來，納米材料的引入使得該方法具有廣闊的應用前景［34］，納米材料較高的酶富集效率使吸附在其上的酶量大幅增加，且由于納米材料有極強的電子傳遞能力使交聯(lián)后的固定化酶對底物和產(chǎn)物的響應較快。

2.4 其他方法

除上述較常用的固定方法外，酶的固定還有共價結合法和吸附法。共價結合法結合較牢固，但載體的活化過程很復雜，反應條件也較劇烈，要獲得較高活力的固定化酶需要嚴格控制條件，因此，應用較少。吸附法固定條件溫和，酶活保留率較高［35］，但制得的固定酶與載體相互作用力弱、容易脫落，因此，吸附法一般與包埋、交聯(lián)等方法結合使用。

以上固定化方法涉及多點結合，分子排列的隨機性導致酶的空間構型被破壞，使酶活性損失或產(chǎn)生擴散抑制等。針對上述問題，定向固定化技術（oriemed immobilization）發(fā)展起來。利用該技術制得的酶傳感器對農(nóng)藥具有極高的敏感性和極低的檢測限［36］，對氧磷的檢測限達10×10－13，低于其他方法固定化酶的檢測限，定向固定化技術剛起步不久，相關的研究也較少，但其優(yōu)良的檢測性能顯示了該固定技術巨大的應用前景。

3 結束語

盡管國內(nèi)外研究者在酶生物傳感器領域做了諸多努力，其在農(nóng)藥殘留在線分析應用上仍然存在一些缺點，例如:1）基于酶抑制原理制得的傳感器選擇性低，因此，目前的EBS檢測只是針對加入單一農(nóng)藥標準溶液的樣品，在實際樣品中的應用很少;2）酶電極重復使用率低，再生較困難，且再生成本較高;3）檢測限偏高，康天放［37］設計的酶電極在每次測定后簡單拋光即可重新固定使用，重復使用率較高，但對樂果和克百威的檢測限高于國家農(nóng)殘限量標準;4）農(nóng)藥提取率低，易造成假陰性結果，張淑平［38］以戊二醛交聯(lián)固定AChE制成的傳感器檢測加標蔬菜中農(nóng)藥含量，檢測性能優(yōu)良，但回收率只有70%左右，而傳統(tǒng)的氣相色譜法接近100%;5）固定化酶還存在對有機溶劑耐受性差和儲藏穩(wěn)定性低等缺點。

盡管如此，酶生物傳感器可以在線連續(xù)監(jiān)測、預處理簡單，具有傳統(tǒng)的氣相液相色譜法無法企及的的優(yōu)勢，仍不失為一種優(yōu)良的檢測農(nóng)殘的方法，正向著高度自動化、微型化與集成化的方向蓬勃迅速地發(fā)展。

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