趙 婷，姚大衛(wèi)，吳志斌，左雨鵬，鄺詠衡，謝天順，馮先玲綜述，沙 鷗△，張 健▲

（1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，廣東深圳518060；2.香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，香港999077）

核糖體失活蛋白及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用與研究進(jìn)展＊

趙 婷1，姚大衛(wèi)2，吳志斌2，左雨鵬2，鄺詠衡2，謝天順1，馮先玲1綜述，沙 鷗1△，張 健1▲

（1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，廣東深圳518060；2.香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，香港999077）

核糖 體失活蛋白；N－糖苷酶；免疫毒素；細(xì)胞因子；逆向運輸

核糖體失活蛋白（ribosome－inactivating proteins，RIPs）是一類具有特殊生物毒性的蛋白。它具有N－糖苷酶活性，可以滅活真核細(xì)胞的核糖體，使其蛋白質(zhì)的生成受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［1］。具體來說，RIPs因其具有N－糖苷酶活性，能夠作用于真核生物28S核糖體RNA大亞基上的莖環(huán)節(jié)構(gòu)頂部GA4324GA的普遍保守的S／R區(qū)域，通過脫嘌呤作用，阻滯了延長因子EF－2與核糖體的結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)核糖體失活，從而不可逆地抑制蛋白質(zhì)合成［2］，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死。RIPs還具有RNA水解酶活性，可以裂解28SRNA的第4 325與4 326位核苷酸之間的磷酸二酯鍵［3－4］。

RIPs的發(fā)現(xiàn)距今已有一百多年的歷史，它是植物產(chǎn)生的一種具有防御和保護自我功能的蛋白質(zhì)［5－7］。RIPs可存在于植物的各個部位，以種子中的含量最高［8］，并且，不同植物種子中RIPs含量也不同。目前，也有人在某些真菌（如蘑菇）、藻類和細(xì)菌（如志賀毒素）中發(fā)現(xiàn)RIPs［9－11］，它們可以抑制蛋白質(zhì)合成，但作用機制和植物RIPs并不是完全相同［12］。起初發(fā)現(xiàn)它們具有共同的RIPs毒性機制，可以抑制真核細(xì)胞核糖體蛋白質(zhì)生物合成，隨后發(fā)現(xiàn)它們還具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗增殖、抗腫瘤、抗艾滋病病毒、抗孕及神經(jīng)毒性等多方面的作用，因此，先后引起農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、生物及醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

1 核糖體失活蛋白的分類及其生物學(xué)活性

目前，依照RIPs結(jié)構(gòu)的不同，可分為3類（或3型）［13］:一型RIPs為單肽鏈堿性蛋白，相對分子質(zhì)量為30×103左右，具有RNA N－糖苷酶活性。包凌等［14］研究發(fā)現(xiàn)，一型RIPs一級結(jié)構(gòu)有很高的同源性，二級結(jié)構(gòu)有較多的α－螺旋和β－折疊，它們具有相似的生物學(xué)活性?？蒲腥藛T還從一些葫蘆的種子中分離提純出一些相對分子質(zhì)量為10×103甚至更小的RIPs，它們的特點是含有豐富的精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺殘基［15］。一型RIPs的單鏈即為具有滅活核糖體功能的活性鏈，具有N－糖苷酶活性，它與細(xì)胞膜上磷脂相互作用，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，但內(nèi)化效率不高，因此，細(xì)胞毒性較小。此外這類RIPs進(jìn)入細(xì)胞的機制還涉及受體非依賴性機制［16］。

二型RIPs為異源二聚體酸性蛋白，分為A、B兩條肽鏈，通過二硫鍵相連，并具有強烈的疏水作用，相對分子質(zhì)量為60×103左右。A鏈與一型RIPs相似，具有RNA N－糖苷酶活性；B鏈對半乳糖結(jié)構(gòu)具有特定的凝集素活性，能與細(xì)胞表面的糖基相互作用，從而幫助A鏈進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒性功能。還有一些二型RIPs由4條多肽鏈組成，實際上是由兩個相同的雙鏈RIPs分子通過次級鍵結(jié)合在一起的二聚體，其性質(zhì)與雙鏈RIPs相同，但毒性相差甚遠(yuǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)，B鏈除了誘導(dǎo)凋亡或壞死的作用外，還具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的功能。這項研究成果，為破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)和骨骼免疫學(xué)的研究提供了新的方向［17］。

三型RIPs比較少見，也是一類單鏈蛋白，包括一個與一型RIPs相似的N端區(qū)域和一個未知功能的C端區(qū)域［18］。其先通過合成無活性的前體，然后在涉及形成活性位點的氨基酸之間進(jìn)行酶解加工才形成成熟RIPs［19］。三型RIPs合成時以無活性的蛋白前體形式存在，當(dāng)活性位點氨基酸中間的二硫鍵以及C末端和N末端的擴展序列被水解之后，三型核糖體才具有活性。

2 RIPs的應(yīng)用

2.1 抗孕 一型RIPs中的中藥天花粉蛋白（TCS），是傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)可的墮胎藥。研究發(fā)現(xiàn)，TCS是通過殺死絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞使胎兒致死。絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞對TCS非常敏感，實驗發(fā)現(xiàn)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞攝入大量的TCS分子后，導(dǎo)致絨毛廣泛變性壞死，纖維素沉著，絨毛間隙閉塞及血循環(huán)受到阻斷，血循環(huán)的阻斷又加速絨毛的變性壞死，促使前列腺素釋放而流產(chǎn)。

2.2 抗腫瘤 早在1970年，Lin等［20］就已研究發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素ricin和相思子毒素abrin對小鼠腹水瘤、Yoshida肉瘤、實驗性白血病、B16黑色素瘤有治療作用。通過臨床觀察及實驗室證明，TCS可直接作用于絨毛滋養(yǎng)葉細(xì)胞，使之變性壞死并可提高機體的免疫功能，從而提出TCS可作為治療惡性滋養(yǎng)葉腫瘤的選用藥物之一。有研究結(jié)果表明，TCS對T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞株的殺傷作用主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的，提示TCS的抗腫瘤細(xì)胞作用與細(xì)胞類型相關(guān)的，并且針對不同類型的細(xì)胞有其不同的機制。最近有研究顯示，分離純化的蓖麻種子毒蛋白，是具有殺死食管癌細(xì)胞的一類RIPs，是穩(wěn)定劑型的蛋白質(zhì)藥物。

但由于RIPs具有很強的免疫原性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生破壞性抗體IgG和IgE，產(chǎn)生一些如過敏反應(yīng)、神經(jīng)和腎臟毒性等不良反應(yīng)，限制了臨床應(yīng)用。后來，免疫毒素的成功研制，為其在臨床的應(yīng)用開辟了新的領(lǐng)域，也成為現(xiàn)在醫(yī)學(xué)界的研究熱點。免疫毒素是抗體與毒素的偶聯(lián)物，能更好地提高毒素作用的靶向性，從而更有效地發(fā)揮毒素的殺傷效應(yīng)。其對腫瘤細(xì)胞的活性比游離毒素強，一般具有更高的療效和更低的毒性。

2.3 神經(jīng)科學(xué)方面的研究成果及應(yīng)用 1982年，首先報道于遠(yuǎn)端迷走神經(jīng)和舌下神經(jīng)內(nèi)注射蓖麻毒素，該毒素沿神經(jīng)向神經(jīng)元細(xì)胞傳輸，使核糖體失活，不可逆地抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。這種毒素逆向軸漿運輸?shù)淖饔?，造成神?jīng)系統(tǒng)的選擇性損傷，稱為“自殺性傳輸”。它們還可以結(jié)合單克隆抗體，治成免疫毒素，對特異性的神經(jīng)元有選擇性的殺傷作用，并被命名為“分子神經(jīng)外科”。隨后發(fā)現(xiàn)多種RIPs都具有類似神經(jīng)毒性，如相思豆毒素、蒴蓮根毒素等。一個細(xì)胞里大約有10%的核糖體失活，就可以殺死這個細(xì)胞。自殺性運輸這種方法多用于實驗用途，如決定神經(jīng)介質(zhì)的細(xì)胞定位、研究在嚴(yán)格限制范圍內(nèi)神經(jīng)元丟失后感覺傳到通路和運動系統(tǒng)的可塑性變化、評估初級感覺神經(jīng)元在自噬行為中的作用等。

由于二型RIPs如蓖麻毒素具有凝集素B鏈，其毒性大，對細(xì)胞的選擇性小。而一型RIPs為單鏈活性鏈，其細(xì)胞毒性就受到了很大的限制。Sha等［21］對兩個結(jié)構(gòu)相似的單鏈RIPs中藥天花粉蛋白TCS和蓖麻毒素A鏈RTA的神經(jīng)毒性進(jìn)行研究后提出，這兩種單鏈RIPs對小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞都具有毒性，引起小鼠視網(wǎng)膜明顯改變。不同的是，TCS通過凋亡殺死特定部位的視網(wǎng)膜細(xì)胞（主要在外核層和內(nèi)核層），而RTA引起視網(wǎng)膜發(fā)炎，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。同時發(fā)現(xiàn)RTA的作用機制和二型RIPs中RCA的作用機制相同，說明二型RIPs的B鏈在神經(jīng)毒性方面可能并不是很必要的。通過這個研究結(jié)果提示RIPs可以應(yīng)用于視網(wǎng)膜模型的創(chuàng)立，TCS可能可以用于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的化療。

香港中文大學(xué)的研究人員還進(jìn)行了對TCS周圍性神經(jīng)毒性的實驗研究，發(fā)現(xiàn)TCS通過周圍神經(jīng)軸突逆向運輸，在相應(yīng)節(jié)段的脊髓前角運動神經(jīng)元幾乎全部死亡而相應(yīng)節(jié)段的背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元僅部分死亡，顯示出TCS對感覺神經(jīng)元具有選擇性神經(jīng)毒性。因此，TCS可以用來誘導(dǎo)神經(jīng)損害，可能可以用于治療慢性痙攣、痛覺過敏和疼痛等的治療。

2010年，Sha等［22］進(jìn)一步研究了TCS引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)毒性在細(xì)胞通路、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)等方面的機制。研究顯示TCS主要通過線粒體退化路徑來誘發(fā)凋亡，TCS可以選擇性地進(jìn)入視網(wǎng)膜的穆勒膠質(zhì)細(xì)胞和色素細(xì)胞，可以引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型和數(shù)量的變化，隨后導(dǎo)致光感細(xì)胞死亡。相反的，RTA可以進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞并破壞血管內(nèi)皮，導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎癥和壞死，更進(jìn)一步地揭示了TCS對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機制，提示筆者可以利用RIPs特異性地殺死某些神經(jīng)，從而減輕這些神經(jīng)帶來的傷害，如頑固性頭痛，從而為臨床上難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。

3 核糖體失活蛋白的檢測

與一型RIPs相比，二型RIPs由于B鏈的凝集素活性，便于進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生較強的細(xì)胞毒性，在人們的日常生活中，應(yīng)提高對RIPs作為毒物的認(rèn)識。如蓖麻毒素毒性極強，為有機磷神經(jīng)毒素的380倍，氰化物的6 000倍?；谄錆撛诘耐{，如今已根據(jù)RIPs的理化性質(zhì)和免疫學(xué)特性研制出多種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法，主要包括免疫熒光技術(shù)、夾心免疫PCR技術(shù)、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)和生物傳感器技術(shù)等，用于檢測RIPs。有研究表明，納米顆粒探針也能夠用于蓖麻毒素等RIPs的檢測，為人們的生命、生活及食品衛(wèi)生安全提供多方面的保障。

此外，RIPs的檢測手段的應(yīng)用并不局限于軍事防恐、食品衛(wèi)生方面。有學(xué)者發(fā)明了應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定麻風(fēng)樹核糖體失活蛋白的方法，為麻風(fēng)樹的綜合利用提供了技術(shù)支持。從而在資源緊缺的今天，使大家可以綜合利用資源，最大可能地少浪費。

4 展 望

綜上所述，RIPs來源廣，易獲得。在生物醫(yī)學(xué)界具有抗增殖、抗腫瘤、抗病毒、抗孕、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用，具有重要的理論和應(yīng)用價值。RIPs抗孕、抗腫瘤方面作用，結(jié)合更多、更高效的免疫毒素的研制，將會給人類帶來意想不到的收獲。使人們在進(jìn)行藥物流產(chǎn)時更安全、更有針對性、效果更好，不良反應(yīng)更小。RIPs在神經(jīng)系統(tǒng)方面的特性，給神經(jīng)科學(xué)研究提供了更好的研究手段。TCS的選擇性神經(jīng)毒性作用有望在難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面得到應(yīng)用。

［1］Endo Y，Tsurugi K.RNA N－glycosidase activity of ricin A chain:mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes［J］.J Biol Chem，1987，262（17）:8128－8130.

［2］Moazed D，Robertson JM，Noller HF.Interaction of elongation factors EF－G and EF－Tu with a conserved loop in 23SrRNA［J］.Nature，1988，334（6180）:362－364.

［3］Perentesis JP，Miller SP，Bodley JW.Protein toxin inhibitors of protein synthesis［J］.Biofactors，1992，3（3）:173－184.

［4］Hartley MR，Lord JM.Cytotoxic ribosome－inactivating lectins from plants［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1701（1／2）:1－14.

［5］Nielsen K，Boston RS.Ribosome－inactivating proteins:a plant perspective［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52:785－816.

［6］Peumans WJ，Hao Q，van Damme EJ.Ribosome－inactivating proteins from plants:more than RNA N－glycosidases［J］.FASEB J，2001，15（9）:1493－1506.

［7］Hartley MR，Lord JM.Cytotoxic ribosome inactivating lectins from plants［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1701（1／2）:1－14.

［8］黃如葵，羅海玲，黃玉輝，等.不同基因型苦瓜種子發(fā)育過程中核糖體失活蛋白的累積變化［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，42（3）:236－239.

［9］Lam SK，Ng TB.First simultaneous isolation of a ribosome inactivating protein and an antifungal proteinmf rom a mushroom（L yophy l2lum shimej i）toget her wit h evidence for synergism of their antifungal effects［J］.Arch Biochem Biophys，2001，393（2）:271－280.

［10］Liu RS，Yang JH，Liu WY.Isolation and enzymatic characterization of lamjapin，t he first ribosome inactivating protein f rom Cry pto2gamic al gal plant［J］.Eur J Biochem，2002，269（19）:4746－4752.

［11］Tesh VL.Activation of cell stress response pathways by shiga toxins［J］.Cell Microbiol，2012，14（1）:1－9.

［12］陳洪章，鄒全明.腸出血性大腸桿菌（EHEC）0157:H7志賀毒素研究進(jìn)展［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2007，23（1）:83－85.

［13］郝勇峰，徐雅琴，王麗波.核糖體失活蛋白及其研究進(jìn)展［C］.生命科學(xué)，2011，23（10）:951－956.

［14］包凌，吳民瀘，聶宇，等.苦瓜籽核糖體失活蛋白的基本性質(zhì)研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報，2009，46（4）:1203－1206.

［15］Ng1TB，Wong JH，Wang H.Recent progress in research on ribosome inactivating proteins［J］.Curr Protein Pept Sci，2010，11（1）:37－53.

［16］Xia XF，Zhang F，Shaw PC，et al.Trichosanthin induces eakage and membrane fusion of liposome［J］.IUBMB Life，2003，55（12）:681－687.

［17］Wang YM，Lu TL，Hsu PN，et al.Ribosome inactivating protein B－chain induces osteoclast differention from monocyte／macrophage lineage precursor cells［J］.Bone，2011，48（66）:1336－1345.

［18］安冉，孫素榮.核糖體失活蛋白在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.疾病預(yù)防控制通報，2011，26（4）:87－89.

［19］Nielsen K，Boston RS.Ribosome inactivating proteins:a plant perspective［J］.Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52:785－816.

［20］Lin JY，Tserng KY，Chen CC，et al.Abrin and ricin:new antitumour substances［J］.Nature，1970，227（5255）:292－293.

［21］Sha O，Kwong WH，Pang Cho EY，et al.Different neuronal toxicity of single－chain ribosome－inactivating proteins on the rat retina［J］.Toxicon，2008，51（1）:45－53.

［22］Shen WZ，Sha O，Yew DT，et al.Retrograde transport of a traditional chinese medicine，alpha－trichosanthin，and its selective neural toxicity［J］.Clin Toxicol（Phila），2009，47（9）:876－883.

［23］Sha O，Yew DT，Cho EY，et al.Mechanism of the specific neuronal toxicity of a type I ribosome－inactivating protein［J］.Neurotox Res，2010，18（2）:161－172.

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