倪志強(qiáng) 方艷秋 譚巖

近年來(lái)，腫瘤的發(fā)生率明顯增高，嚴(yán)重影響人們的生命安全和生活質(zhì)量。雖然腫瘤的治療方法不斷提高，但其病死率仍然居高不下。非小細(xì)胞肺癌化療敏感性較小細(xì)胞肺癌差，且發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，患者的預(yù)后較差，故尋找有效的靶向治療具有重要的臨床意義。Pim家族是一組參與鈣調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白激酶，Pim蛋白具有抗凋亡的作用，Pim-3作為Pim家族的新成員，已有基礎(chǔ)研究證實(shí)其與肺癌A549細(xì)胞的凋亡明顯相關(guān)[1]，但Pim-3與臨床非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道，故筆者對(duì)Pim-3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2012年5月的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本40例（男26例，女性14例），年齡37～78歲，平均65歲。所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療、生物治療或其他抗腫瘤治療；其中腺癌17例，鱗癌23例；分化程度：I級(jí)11例，II級(jí)9例，III級(jí)10例，IV級(jí)10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例。選擇我院同期因肺膿腫或肺外傷手術(shù)患者40例的正常肺組織作為正常對(duì)照組。

1.2 免疫組化法檢測(cè)肺組織Pim-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min×2次；5%～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h或4℃過(guò)夜；PBS沖洗，5min×3次；滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30min；PBS沖洗，5min×3次；滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min；PBS沖洗，5min×3次；顯色劑顯色3～15min（DAB）；自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上的棕黃色顆粒為Pim-3陽(yáng)性表達(dá)，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中凋亡細(xì)胞百分比 手術(shù)標(biāo)本分離單細(xì)胞懸液，經(jīng)Annexin V與核酸染料標(biāo)記后采用流式細(xì)胞儀測(cè)定肺組織中細(xì)胞凋亡率。具體步驟：取Falcon試管，按標(biāo)本順序編好陰性對(duì)照管和標(biāo)本管號(hào)。使用冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，再用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106/mL的懸液。Falcon試管中加入100μ L細(xì)胞懸液。按體積加入Annexin V與核酸染料。輕輕混勻，室溫（20℃～25℃）避光處放置15min。各實(shí)驗(yàn)管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μL。1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。

1.4 Pim-3陽(yáng)性表達(dá)與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性 比較不同臨床病理特征肺癌組織中的Pim-3的陽(yáng)性率，判斷Pim-3陽(yáng)性表達(dá)與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肺組織中Pim-3的陽(yáng)性率 非小細(xì)胞肺癌組織中Pim-3的陽(yáng)性率高達(dá)87.5%（35/40），明顯高于正常肺組織中Pim-3的陽(yáng)性率5%(2/40)，P＜0.05。

2.2 不同肺組織中細(xì)胞凋亡率 非小細(xì)胞肺癌組織中細(xì)胞凋亡率明顯低于正常肺組織（22% vs 55.8%，P＜0.05）。

2.3 Pim-3陽(yáng)性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的相關(guān)性 Pim-3的陽(yáng)性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的性別（男性87.3%，女性86.9%）、年齡（≥60歲患者85.0%，＜60歲者88.4%）、腫瘤大?。ā?cm 88.1%，＜3cm 83.2%）、腫瘤病理類型（腺癌89.2%，鱗癌85.4%）無(wú)關(guān)，與腫瘤分化程度（I+II期56.5%，III+IV期90.2%）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切（無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組43.9%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組91.6%）相關(guān)。

3 討論

Pim-3基因位于人類染色體22q13，為35 600 bp長(zhǎng)度[2]，其mRNA表達(dá)于大腦、心臟、腎臟、脾臟、胎盤(pán)、骨骼肌及外周血白細(xì)胞，在結(jié)腸、胸腺、肝臟及小腸正常組織中不表達(dá)[3]。目前研究表明，Pim-3可能通過(guò)以下途徑發(fā)揮生物學(xué)作用：(1)調(diào)控Bcl-2家族的抗凋亡蛋白或抑制凋亡基因Bad和G6-1，抑制細(xì)胞凋亡；(2)激活CDC25A，促進(jìn)細(xì)胞的G1進(jìn)程，抑制C-TAK1的活性，促進(jìn)G2/M的轉(zhuǎn)換；(3)激活STAT-3信號(hào)途徑，促進(jìn)G2/M進(jìn)程；(4)抑制磷酸酶活性，阻止細(xì)胞凋亡[4]。本文采用免疫組化方法檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中Pim-3的陽(yáng)性率，結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組織中Pim-3陽(yáng)性率明顯增高，提示Pim-3的過(guò)表達(dá)參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展。進(jìn)一步凋亡率檢測(cè)結(jié)果提示，肺癌組織中的細(xì)胞凋亡率明顯低于正常肺組織，說(shuō)明Pim-3通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的凋亡率參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，與上述研究結(jié)果相似。同時(shí)，本文對(duì)Pim-3陽(yáng)性率與肺癌的臨床病理特征進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，結(jié)果顯示Pim-3陽(yáng)性率與患者性別、年齡、病理類型無(wú)關(guān)，而與腫瘤分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，證實(shí)Pim-3的生物活性與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Pim-3可以成為非小細(xì)胞肺癌靶向治療的目的基因，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷成熟及臨床研究的不斷發(fā)展，有望為提高非小細(xì)胞肺癌療效提供理論依據(jù)。

[1]羅強(qiáng)，熊暢，熊珊，等.Pim-3在肺癌組織中的表達(dá)[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，26（1）：16-18.

[2]孫守亮，錢軍.pim-3基因及其相關(guān)作用[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2012，39（2）：105-108.

[3]Fujii C,Nakamoto Y,Lu P,et al.Aberrant expression of serine and threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines[J].I nt J Cancer,2005,114(2)：209-218.

[4]Bachmann M,Moroy T.The serine/threonine kinase Pim-1[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,37（4）：726-730.