朱益波，朱明，朱雪

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.大富豪（常熟）啤酒有限公司，江蘇常熟 215500）

啤酒釀造廢酵母H2O2氧化脅迫下細(xì)胞衍生物的研究

朱益波1，朱明2，朱雪1

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.大富豪（常熟）啤酒有限公司，江蘇常熟 215500）

為更好地利用大量的廢啤酒酵母資源，研究了廢酵母在H2O2氧化脅迫下形成的活酵母細(xì)胞衍生物（LYCD）的活性，優(yōu)化了脅迫條件.研究結(jié)果表明：廢酵母細(xì)胞經(jīng)終濃度0.2 mmol/L H2O2脅迫15 min形成的促細(xì)胞生長(zhǎng)活性最高，超氧化物歧化酶（SOD）活力是對(duì)照的18倍，丙二醛（MDA）含量約為對(duì)照的40%；SOD的活力與MDA含量呈現(xiàn)大致的反比關(guān)系；脅迫30 min，LYCD中還原型谷胱甘肽（GSH）是對(duì)照的2.7倍；活性物質(zhì)的最高值并未在相同的脅迫條件下出現(xiàn).

啤酒廢酵母；活酵母細(xì)胞衍生物；氧化脅迫

酵母細(xì)胞在受到應(yīng)激脅迫，比如紫外照射、高低溫、氧化壓力等刺激時(shí)，會(huì)啟動(dòng)多種應(yīng)激機(jī)制產(chǎn)生多種活性物質(zhì)以抵御不良環(huán)境的刺激[1].有學(xué)者將這些物質(zhì)稱為活細(xì)胞酵母衍生物（LYCD）[2]，對(duì)于LYCD的研究表明，它主要由氨基酸、單糖、雙糖、維生素和礦物質(zhì)等活性物質(zhì)組成.LYCD的應(yīng)用研究表明其具備促進(jìn)膠原和彈性蛋白的產(chǎn)生、加速傷口愈合的功能[3]，以及能增加皮膚細(xì)胞中的新生蛋白質(zhì)對(duì)水分吸收和促進(jìn)細(xì)胞線粒體對(duì)氧的利用，使細(xì)胞的呼吸和能量代謝過(guò)程更為有效，因此LYCD在化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[4].目前國(guó)內(nèi)關(guān)于LYCD的應(yīng)用和機(jī)理研究主要側(cè)重于應(yīng)激培養(yǎng)條件對(duì)酵母細(xì)胞衍生物中相關(guān)活性成分的影響[4-8]，以及活性物質(zhì)中多糖的純化和結(jié)構(gòu)測(cè)定[9].我國(guó)現(xiàn)在已經(jīng)是啤酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，每年大量的啤酒廢酵母沒有得到綜合利用而造成嚴(yán)重資源浪費(fèi)和環(huán)境污染.目前關(guān)于利用啤酒廢酵母細(xì)胞生產(chǎn)LYCD的研究還較少，主要是張健等人研究了廢啤酒酵母在含重金屬?gòu)U液中培養(yǎng)啤酒酵母生產(chǎn)LYCD的工藝[10].本文旨在研究新鮮啤酒廢酵母在H2O2的氧化脅迫下，活細(xì)胞衍生物的活性物質(zhì)變化規(guī)律，摸索最適作用條件，為利用氧化壓力脅迫啤酒廢酵母生產(chǎn)LYCD提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

釀酒酵母：實(shí)驗(yàn)室保存，用于LYCD活性測(cè)定.

廢啤酒酵母：大富豪（常熟）啤酒有限公司提供發(fā)酵后期沉降酵母，收集分裝于無(wú)菌三角瓶后待用；

培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）；

試劑：30%H2O2；無(wú)水乙醇；冰醋酸；鄰苯二甲醛；連苯三酚；還原型谷胱甘肽；三氯乙酸；MDA測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）.

1.2 主要儀器與設(shè)備

JY-98-Ⅲ超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；島津RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)；島津UV-2550型紫外-可見光分光光度計(jì)；培養(yǎng)箱；水浴搖床；冷凍離心機(jī).

1.3 方法

1.3.1 啤酒廢酵母預(yù)處理

新收集的啤酒廢酵母懸浮于預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水，洗滌三次除去吸附于酵母表面的雜質(zhì).取清洗后的酵母細(xì)胞懸液25 ml分裝于50 ml無(wú)菌離心管中，4℃、5000 r/min離心10 min，去上清液后冷藏保存待用.

1.3.2 H2O2半數(shù)致死濃度的測(cè)定

取一定量廢啤酒酵母細(xì)胞懸液，加入一定量的H2O2，使其作用終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0、2.5 mmol/L，28℃，150 r/min培養(yǎng)30 min后，樣液用無(wú)菌生理鹽水（0.9%）稀釋相應(yīng)倍數(shù)后，傾注培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測(cè)定H2O2作用前后的活菌數(shù)量，計(jì)算存活率.以酵母細(xì)胞約50%致死時(shí)的H2O2濃度作為H2O2對(duì)酵母細(xì)胞的半數(shù)致死濃度.

1.3.3 LYCD的制備和活性測(cè)定

LYCD制備：取一定量廢啤酒酵母細(xì)胞懸液，加入H2O2至相應(yīng)濃度，28℃，150 r/min脅迫一定時(shí)間，離心（3500 r/min，10 min）收集菌體，并用無(wú)菌水洗滌一次，然后加入適量的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，同上條件培養(yǎng)3 h，離心（3500 r/min，10 min）收集菌體，冰浴超聲波破壁（工作時(shí)間3 s，間隙時(shí)間5 s，400 W，工作次數(shù)60）并用4℃的無(wú)菌水轉(zhuǎn)移破碎物，經(jīng)10000 r/min離心5 min后，取上清液，即為該H2O2脅迫作用條件下的LYCD.對(duì)照酵母細(xì)胞提取物（YE）除不進(jìn)行氧化脅迫外其余操作同上.

LYCD活性測(cè)定：取一定體積培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的釀酒酵母細(xì)胞懸液，加入等體積的LYCD和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，28℃，150 r/min培養(yǎng)1 h，測(cè)定培養(yǎng)前后OD256的變化，以此間接反映LYCD活性的大小.

1.3.4 LYCD中谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定

取新鮮制備的LYCD或YE，然后按照體積比1：10加入三氯乙酸（TCA），混勻，在冷藏箱內(nèi)放置60 min，10000 r/min離心5 min，上清液即為所需的樣品.然后按照文獻(xiàn)[11]描述的方法測(cè)定GSH的含量.

1.3.5 LYCD中SOD酶活力測(cè)定：鄰苯三酚自氧化法[12]

酶活性單位的定義為：每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定義為一個(gè)活性單位.

1.3.6 LYCD中MDA的測(cè)定

參照MDA測(cè)定試劑盒中說(shuō)明書進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2脅迫最適條件分析

2.1.1 H2O2對(duì)廢啤酒酵母半數(shù)致死濃度

為考察H2O2對(duì)于廢啤酒酵母細(xì)胞的毒性，進(jìn)而確定大致的處理濃度范圍，故首先考察了在脅迫30 min下，處理濃度與酵母細(xì)胞存活率的關(guān)系.廢啤酒酵母細(xì)胞存活率與H2O2處理濃度的關(guān)系如圖1所示.由圖可見隨著加入H2O2濃度由0增加到0.8 mmol/L時(shí)，菌體的存活率迅速下降.當(dāng)H2O2的作用濃度為0.6 mmol/L時(shí)細(xì)胞的存活率僅為44%，說(shuō)明該處理濃度接近H2O2對(duì)酵母細(xì)胞的半數(shù)致死濃度.此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相關(guān)處理濃度應(yīng)該低于該半數(shù)致死濃度.

2.1.2 H2O2作用濃度及時(shí)間的優(yōu)化

選用不同濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）的H2O2作用于廢酵母懸液，作用時(shí)間為30 min，離心終止作用后制備LYCD.然后測(cè)定其活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2a.當(dāng)作用濃度為0.2 mmol/L時(shí)所引起的酵母培養(yǎng)液的△OD256的值為0.375，達(dá)到最大值，即此時(shí)產(chǎn)生的LYCD的活性最強(qiáng)，所以，實(shí)驗(yàn)確定H2O2的最佳作用濃度為0.2 mmol/L.

然后以0.2 mmol/L的H2O2作用于廢酵母懸液，作用時(shí)間分別為0、15、30、45、60 min，離心終止作用后制備LYCD.測(cè)定其活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2b.處理時(shí)間為15 min提取的LYCD顯著促進(jìn)了酵母細(xì)胞培養(yǎng)液OD256的增加，達(dá)到了0.4，是對(duì)照樣品的1.55倍.處理時(shí)間增加，促進(jìn)效果開始下降，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到45 min時(shí)，獲得的LYCD的相對(duì)活性和對(duì)照相當(dāng)，說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)于LYCD的活性有顯著影響，這可能與過(guò)長(zhǎng)時(shí)間處理使得廢啤酒酵母細(xì)胞大量死亡，無(wú)法產(chǎn)生抗逆性活性物質(zhì)有關(guān).另有研究表明當(dāng)酵母細(xì)胞暴露于亞致死量外源H2O2中時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)隨著H2O2的適應(yīng)性反應(yīng)迅速發(fā)生變化，改變膜的成分，使膜的通透性發(fā)生改變，從而形成跨膜梯度，提高細(xì)胞對(duì)H2O2的耐受性[13].故也有可能是由于細(xì)胞膜成分改變導(dǎo)致跨膜梯度形成減少了H2O2對(duì)細(xì)胞的損害.綜合圖2的結(jié)果可認(rèn)為H2O2處理濃度為0.2 mmol/L，處理時(shí)間15 min到30 min獲得的LYCD活性較高.

圖1 H2O2處理濃度對(duì)酵母細(xì)胞存活率影響

圖2 處理濃度與時(shí)間對(duì)LYCD的影響

2.2 LYCD中活性物質(zhì)的測(cè)定

2.2.1 GSH含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線及LYCD中GSH含量分析

配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫放置40 min后，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定（40 min到70 min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小，數(shù)據(jù)未列出）.以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示.得線性回歸方程為：Y=52.702X-0.2832，R2=0.999.標(biāo)準(zhǔn)曲線表明GSH的濃度在0.08 ug/mL到0.72 ug/mL之間時(shí)，其濃度與熒光強(qiáng)度值有很好的線性關(guān)系，可以作為計(jì)算樣品中GSH含量的依據(jù).

將0.2 mmol/L H2O2處理相應(yīng)時(shí)間后新鮮制備的LYCD和YE經(jīng)適當(dāng)稀釋，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定樣品中GSH含量，所得結(jié)果如圖4所示.由圖可以看出0.2 mmol/L H2O2刺激30 min時(shí)，LYCD中的GSH含量高達(dá)15.2 ug/mL，而對(duì)照YE中的GSH含量?jī)H為5.7 ug/mL（圖中未列出），脅迫后細(xì)胞提取物中的GSH含量均高于對(duì)照YE中的GSH含量（即使作用時(shí)間60 min對(duì)應(yīng)的GSH含量降低到7.1 ug/mL也明顯高于對(duì)照的5.7 ug/mL）.即經(jīng)過(guò)H2O2刺激產(chǎn)生的酵母衍生物L(fēng)YCD中的GSH含量要顯著高于未經(jīng)H2O2刺激處理的細(xì)胞提取物YE.眾多研究表明，GSH具有抗氧化和清除體內(nèi)自由基的功能.細(xì)胞在氧化及其他環(huán)境壓力下會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)保護(hù)機(jī)制維持胞內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原環(huán)境，而GSH就是其中一種非常重要的物質(zhì)[14].本研究的結(jié)果表明廢啤酒酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)H2O2的脅迫，也可以通過(guò)激活體內(nèi)的抗性機(jī)制產(chǎn)生GSH來(lái)抵御外界氧化壓力.另外，在刺激時(shí)間為30 min時(shí)，GSH的含量要顯著高于其他作用時(shí)間所產(chǎn)生的量，這可能是基于以下兩個(gè)原因：一是該測(cè)定方法是測(cè)定還原型谷胱甘肽的含量，而在脅迫下可能一部分還原型谷胱甘肽已經(jīng)變成氧化態(tài)，從而不能檢測(cè)出；二是脅迫時(shí)間過(guò)短可能在細(xì)胞做出響應(yīng)時(shí)，環(huán)境壓力突然消失，而脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞存活率低而導(dǎo)致GSH含量下降.具體是什么原因還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證.

2.2.2 LYCD中SOD活性分析

測(cè)定上述制備的LYCD中SOD總酶活，結(jié)果見圖5.在H2O2脅迫不同時(shí)間后，細(xì)胞衍生物中SOD酶活性發(fā)生顯著變化：脅迫10 min和15 min，SOD總活力分別迅速增加為對(duì)照的約14和18倍，刺激15 min制備的LYCD中SOD活力達(dá)到了最大值；脅迫時(shí)間超過(guò)15 min，細(xì)胞內(nèi)的SOD活力又逐漸下降，刺激60 min，SOD總活性下降至僅有30 U左右.

有研究表明外源添加H2O2可以直接作用于細(xì)胞蛋白質(zhì)或者跨過(guò)細(xì)胞膜后進(jìn)一步與亞鐵離子反應(yīng)產(chǎn)生自由基，進(jìn)而對(duì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)甚至DNA產(chǎn)生傷害[15].LYCD中SOD酶活性的顯著變化表明細(xì)胞經(jīng)H2O2的脅迫后，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，并誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)編碼SOD基因的表達(dá)以消除脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子自由基.而對(duì)于不同脅迫時(shí)間下SOD酶活性的變化原因可能與前面的分析類似.從圖2，圖4和圖5的結(jié)果來(lái)看，SOD最高值出現(xiàn)在脅迫15 min后，GSH最高值為脅迫30 min后，而LYCD活力在脅迫15 min～30 min都維持在比較高的范圍內(nèi).這一結(jié)果表明在不同的脅迫時(shí)間，細(xì)胞內(nèi)抗氧化脅迫物質(zhì)呈動(dòng)態(tài)變化，GSH的含量和SOD的活力都是LYCD活力的組成部分.

2.2.3 LYCD中MDA含量分析

圖3 熒光法測(cè)定GSH含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 處理時(shí)間對(duì)LYCD中GSH含量的影響

圖5 處理時(shí)間對(duì)LYCD中SOD活性的影響

對(duì)于LYCD中MDA含量的測(cè)定結(jié)果見圖6.從圖可以看出，經(jīng)0.2 mmol/L H2O2脅迫后的LYCD中的MDA含量明顯要少于未經(jīng)脅迫細(xì)胞提取物中的MDA含量.MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，通過(guò)MDA含量可以間接地反映機(jī)體受自由基損傷的程度，而SOD的活性則可間接地反映機(jī)體清除自由基的能力，結(jié)合圖5可以看出，LYCD中的MDA含量與SOD的活性呈大致的反比關(guān)系，即在SOD的活性較高時(shí)MDA的含量較低，這也間接表明在H2O2脅迫下酵母細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)主動(dòng)地產(chǎn)生了抗氧化成分如SOD等來(lái)清除氧自由基以保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害.脅迫15 min時(shí)這種應(yīng)激反應(yīng)清除氧自由基的程度最大，此時(shí)MDA含量最少，約只有對(duì)照MDA含量的40%，這一點(diǎn)與此處理產(chǎn)生的SOD活性最強(qiáng)的結(jié)論是吻合的.

圖6 處理時(shí)間對(duì)LYCD中MDA濃度的影響

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)LYCD中MDA、GSH和SOD這兩種抗氧化成分結(jié)合LYCD活性的研究分析結(jié)果可得出以下結(jié)論：

（1）廢啤酒酵母細(xì)胞在終濃度0.2 mmol/L H2O2環(huán)境中脅迫15 min，細(xì)胞產(chǎn)生的LYCD的活性最高；

（2）采用0.2 mmol/L H2O2脅迫廢啤酒酵母細(xì)胞30 min，細(xì)胞在氧化應(yīng)激反應(yīng)中形成的GSH含量最高，約為對(duì)照的2.7倍；脅迫15 min，細(xì)胞內(nèi)SOD活力最高，約是對(duì)照的18倍，對(duì)應(yīng)的MDA含量只有約對(duì)照的40%；

（3）MDA含量與LYCD中SOD總活性大致呈反比關(guān)系，這表明SOD消除了氧自由基，進(jìn)而減少了MDA的產(chǎn)生；

（4）LYCD的活性是各種應(yīng)激活性成分（如GSH、SOD、多種活性蛋白和多糖等）所產(chǎn)生的綜合效果，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，各活性成分并非同時(shí)達(dá)到活性最高值.

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A Study on Cell Derivative of Waste Beer Yeast under H2O2Oxidative Stress

ZHU Yi-bo1,ZHU Ming2,ZHU Xue1
(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China; 2.Dafuhao Brewery(Changshu)Ltd.,Changshu 215500,China)

For the purpose of utilizing abundant waste yeast resource,the activity of living yeast cell derivative (LYCD)from yeast cell under H2O2oxidative stress was studied.Results showed that:the activity of LYCD reached peak level after 15-minute stress with final concentration 0.2 mmol/L H2O2;Superoxide dismutase (SOD)activity was 18 times as high as that of the control,whereas malonaldehyde(MDA)concentration was about 40%of that in control;SOD activity and MDA concentration presented inverse ratio relationship;Reduced glutathione concentration was 2.7 times as high as that of control after 30-minute stress with final concentration 0.2mmol/L H2O2;The active substances in LYCD did not simultaneously reach the highest level.

waste yeast;living yeast cell derivative;oxidative stress

Q939.97

A

1008-2794（2012）10-0065-05

2012-09-15

江蘇省高校自然科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目“新型非降解技術(shù)提取啤酒酵母β-D葡聚糖的工藝研究”（08KJD180006）

朱益波（1980—），男，江蘇靖江人，講師，博士，研究方向：基因工程與發(fā)酵工程．