曾冬明，侯麗，施燕平

1 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，濟(jì)南，250101 2 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南，250101

【作 者】田少雷國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心，北京市，100061

醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展

【作者】曾冬明1，2，侯麗1，2，施燕平1，2

1 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，濟(jì)南，250101 2 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南，250101

簡(jiǎn)要地介紹了國(guó)內(nèi)外醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展，并分析了未來的發(fā)展趨勢(shì)。

醫(yī)療器械；遺傳毒性；應(yīng)用現(xiàn)狀；研究進(jìn)展

【 Abstract 】The overseas and domestic application status and research progress of genotoxicity evaluation of medical devices is

briefly introudeced. The trend of future development is analyzed.

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，用于醫(yī)療器械產(chǎn)品的新技術(shù)、新材料日益豐富與多樣。大量新型醫(yī)療器械產(chǎn)品的涌現(xiàn)，要求毒理檢測(cè)部門對(duì)其毒性作出及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)與判斷，其中遺傳毒性檢測(cè)是其重要的內(nèi)容之一。遺傳毒性試驗(yàn)作為醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)內(nèi)容始于八十年代后期。ISO/TCl94醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)委員會(huì)的成立和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定[1]，對(duì)于促進(jìn)醫(yī)療器械行業(yè)、保障人類健康的發(fā)展發(fā)揮了重要作用。由于沒有單獨(dú)一個(gè)遺傳毒性試驗(yàn)方法可檢測(cè)所有的遺傳毒性終點(diǎn)，故遺傳毒性的評(píng)價(jià)大多采用組合試驗(yàn)的方法。各國(guó)制定的遺傳毒性試驗(yàn)項(xiàng)目在方法學(xué)分類上較為接近，但具體的方法組合不盡相同，甚至同一國(guó)家中不同實(shí)驗(yàn)室之間也有差異。近年來，隨著毒理學(xué)相關(guān)領(lǐng)域特別是分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳毒性測(cè)試評(píng)價(jià)方法也在不斷改進(jìn)與完善。本文概述了目前遺傳毒性試驗(yàn)諸多評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用情況及該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并淺析今后的發(fā)展趨勢(shì)。

1 醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn)方法的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 國(guó)外遺傳毒性試驗(yàn)組合

經(jīng)過多年的發(fā)展，遺傳毒性試驗(yàn)已經(jīng)了包括原核生物、真核生物、體內(nèi)和體外試驗(yàn)等多種體系，所涉及的方法已經(jīng)超過200種[2]。這些方法各有優(yōu)劣，尚未發(fā)現(xiàn)一種單一的試驗(yàn)方法在檢測(cè)終點(diǎn)的覆蓋范圍、DNA損傷等多種遺傳特異性等檢測(cè)方面均達(dá)到令人滿意的程度。因此，國(guó)內(nèi)外同行都一致認(rèn)為，只有使用一組試驗(yàn)方法，才能對(duì)化學(xué)物的遺傳毒性作出較可靠的評(píng)價(jià)。各國(guó)采用的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法較為相似，但具體的實(shí)施方案有所不同[2-3]。

表1 一些國(guó)家醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn)組合Tab.1 Medical advices in some coutries

1.2 國(guó)內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)與采用的試驗(yàn)組合方法

目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)方法主要依據(jù)GB/T 16886.3-2008（等同轉(zhuǎn)化ISO 10993-3:2003）標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)明確提出，當(dāng)應(yīng)對(duì)醫(yī)療器械的遺傳毒性進(jìn)行試驗(yàn)評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)采用體外系列試驗(yàn)。在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)至少在兩項(xiàng)試驗(yàn)中使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行不同試驗(yàn)終點(diǎn)的研究[4]。該系列試驗(yàn)包括以下兩種方案的試驗(yàn)。

1.2.1 方案一

(1) 細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)（OECD471）；

(2) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)（OECD476）；

(3) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘裂性試驗(yàn)（OECD473）。

1.2.2 方案二

(1) 細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)（OECD471）；

(2) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)（OECD476），特別是小鼠淋巴瘤試驗(yàn)包含集落數(shù)和尺寸測(cè)定，可覆蓋兩個(gè)終點(diǎn)（誘裂性和基因突變）。

國(guó)內(nèi)醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)室一般的試驗(yàn)組合為Ames試驗(yàn)，體外染色體畸變?cè)囼?yàn)（CA）和小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)（MLA），其中MLA試驗(yàn)多采用96微孔板法。由于MLA試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)推廣的時(shí)間不長(zhǎng)，試驗(yàn)本身操作需專門的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，故不少實(shí)驗(yàn)室采用V79細(xì)胞HGPRT基因位點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)或體內(nèi)試驗(yàn)代替。

1.3 現(xiàn)有評(píng)價(jià)體系的缺陷

在目前的醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)方法中，不管是ISO、OECD還是GB，關(guān)于遺傳毒性評(píng)價(jià)方法都只是方法性的概述，各試驗(yàn)方法并沒有建立行標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室之間方法雖然大抵相似，但具體操作甚至某些試驗(yàn)參數(shù)仍存在差異，不利實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的比對(duì)。Ames試驗(yàn)作為遺傳毒性試驗(yàn)的奠基石，其方法從建立至今，已歷經(jīng)多次修改，積累了大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但因其菌株突變的高度特異性，有些突變誘導(dǎo)物難以檢出，且對(duì)于一些有毒物質(zhì)或非澄清狀態(tài)的樣品浸提液，會(huì)產(chǎn)生小菌落的本底，容易誤判為陽(yáng)性結(jié)果。體外染色體畸變?cè)囼?yàn)和小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)，對(duì)試驗(yàn)人員的操作技能及結(jié)果判讀有較高的要求（需較多的經(jīng)驗(yàn)）。在預(yù)測(cè)受試物的致癌性方面，兩個(gè)試驗(yàn)雖然具有很高的敏感性，但特異性卻很低[5-7]。這種高頻率的假陽(yáng)性事件一方面降低了檢測(cè)效率，一方面可能會(huì)造成一些無辜樣品的誤判。此外，小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)只能間接評(píng)價(jià)染色體畸變，對(duì)于一些粘度較高的樣品，無法有效分離細(xì)胞而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。對(duì)于體外試驗(yàn)，S9的使用容易導(dǎo)致一些未知結(jié)果的產(chǎn)生，如有些含銀產(chǎn)品的Ames試驗(yàn)檢測(cè)，與不加S9的組別相比較，有明顯差異。對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)，現(xiàn)有的方法很難確定樣品浸提液的有效成分是否到達(dá)目標(biāo)靶點(diǎn)，敏感性較體外方法差。

2 醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)方法的研究進(jìn)展

醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)方法與藥物和其他化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)方法大同小異，前者來自于后者。因此，目前見報(bào)導(dǎo)的的新方法很少或幾乎沒有以醫(yī)療器械作為對(duì)象的，但這并不影響方法之間的借鑒與共用，因?yàn)槎拘栽u(píng)價(jià)的本質(zhì)對(duì)象都是化合物。以下介紹幾種較有應(yīng)用前景的方法：

2.1 Ames(II)[8]

1994年Ames建立了一套6個(gè)鼠傷寒沙門氏菌株(TA7001－TA7006)，可鑒定6種堿基對(duì)置換突變，每一菌株攜帶一專一的組氨酸生物合成操縱子的錯(cuò)義突變。除組氨酸突變外，這些菌株還攜帶了不同的可增強(qiáng)靶組氨酸突變的附加特性，包括具有SOS可誘導(dǎo)的mucAB系統(tǒng)的R因子pKM101、uvrB切除修復(fù)組分的缺失和rfa突變。這些菌株的自發(fā)回變率相當(dāng)?shù)?約＜10個(gè)回復(fù)突變數(shù)/皿)，檢測(cè)各種致突變物的敏感性相當(dāng)于TA100、TA102和TA104菌株。試驗(yàn)可在24或96微孔板上進(jìn)行，在培養(yǎng)基中加入pH指示劑。當(dāng)回復(fù)突變的菌株生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)基pH改變，pH指示劑由紅變黃，通過分光光度計(jì)測(cè)定，全過程自動(dòng)加樣、自動(dòng)讀數(shù)，只需很少量的受試物就可以在短時(shí)間內(nèi)篩選大量樣品，整個(gè)測(cè)試過程可在90 min內(nèi)完成[9]。該試驗(yàn)在不需序列分析情況下即可鑒定突變譜。近來有人將TA1535、TA1537菌株及大腸桿菌（wp2 uvrA和wp2[pKM101]）納入了Ames II試驗(yàn)[10]，在試驗(yàn)菌株組合方面有了較大的選擇性。

2.2 熒光原位雜交(FISH)技術(shù)

熒光原位雜交最早由Bauman(1980)建立，1989年由Lucas首先用于染色體畸變分析。其原理是按檢測(cè)目標(biāo)準(zhǔn)備合適的DNA序列作為探針，并用生物素標(biāo)記，對(duì)載玻片上待測(cè)標(biāo)本中的DNA雜交，最后通過雜交位點(diǎn)的熒光觀察染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的改變。應(yīng)用特殊染色體和染色體某區(qū)域的熒光探針，可在體內(nèi)檢測(cè)4種類型的細(xì)胞遺傳學(xué)終點(diǎn)[11]：1)檢測(cè)中期細(xì)胞染色體畸變；2)應(yīng)用亞染色體區(qū)域的探針檢測(cè)間期染色體斷裂和非整倍體；3)應(yīng)用中心粒探針和/或抗著絲點(diǎn)抗體檢測(cè)微核的形成；4)哺乳動(dòng)物精子非整倍體檢測(cè)。

2.3 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（彗星試驗(yàn)）

單細(xì)胞凝膠電泳分析(SCGE)是Ostling等(1984)首創(chuàng)的，1988年經(jīng)Singh等進(jìn)一步完善而逐漸發(fā)展起來的一種快速檢測(cè)單細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)方法，因其細(xì)胞電泳形狀頗似慧星，又稱慧星試驗(yàn)(cometassay)。該試驗(yàn)可檢測(cè)不同細(xì)胞 (如皮膚角質(zhì)細(xì)胞、鼻呼吸和嗅覺細(xì)胞、精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞等)少量的DNA鏈斷裂，方法快速簡(jiǎn)便。與經(jīng)典的染色體畸變、微核等試驗(yàn)相比，SCGE可用于活細(xì)胞DNA的檢測(cè)，也能用于死亡細(xì)胞DNA的分析，不僅可以研究低劑量下的生物效應(yīng)，也可用于研究高劑量下的生物效應(yīng)，而且SCGE還可提供DNA修復(fù)能力的信息，這使得SCGE非常適用于評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性[12]。最近，Stang 等[13]利用一種特制的96孔板，改進(jìn)了傳統(tǒng)的彗星試驗(yàn)方法，使高通量的檢測(cè)成為可能。

2.4 轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)系統(tǒng)[14-18]

2.4.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物突變檢測(cè)系統(tǒng)

自1989 年Gossen 等建立第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測(cè)模型以來, 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)自發(fā)突變和誘發(fā)突變的一種新的研究方法。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可在同一個(gè)動(dòng)物體可在整體狀態(tài)下檢測(cè)基因突變，比較不同組織(包括生殖腺)的突變率，確定靶器官，對(duì)誘發(fā)的遺傳改變作精確的分析。這些方法的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可觀察低劑量下的遺傳毒性，因而更符合人體的實(shí)際情況。目前已建立了10多種轉(zhuǎn)基因突變檢測(cè)模型。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)

該方法是將代謝酶基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如MCL細(xì)胞系表達(dá)5種主要類型的cyp450酶，可用于測(cè)試基因突變、微核等遺傳毒性終點(diǎn)；GPTAS52哺乳動(dòng)物致突變系統(tǒng)，包括了細(xì)菌的GPT基因，可用于測(cè)試基因突變。

2.4.3 轉(zhuǎn)基因細(xì)菌

將N－乙酰轉(zhuǎn)移酶、硝基還原酶和細(xì)胞色素p450等參與致突變物活化的基因?qū)爰?xì)菌或酵母致突變實(shí)驗(yàn)菌株，構(gòu)成細(xì)菌或酵母突變測(cè)試系統(tǒng)。特別是導(dǎo)入人體的代謝酶基因，可模擬人體的代謝情況。

3 結(jié)束語

從本實(shí)驗(yàn)室多年來檢測(cè)的樣品來看，醫(yī)療器械產(chǎn)品無論是數(shù)量還是品種正呈現(xiàn)逐年增多的趨勢(shì)，目前的遺傳毒性評(píng)價(jià)體系顯然不能滿足需求。因此，醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)今后的主要發(fā)展趨勢(shì)之一是高通量篩檢方法。目前高通量篩檢方法的建立雖已有較成熟的技術(shù)支撐，比如基因芯片技術(shù)，Ames（II）試驗(yàn)及高通量彗星試驗(yàn)等，但如何選取試驗(yàn)組合及試驗(yàn)劑量等仍需進(jìn)一步摸索。此外，因醫(yī)療器械產(chǎn)品檢測(cè)不同于藥品和其他化合物，一般采用模擬臨床的浸提法制備試驗(yàn)液，各種新工藝的更新升級(jí)必然導(dǎo)致試驗(yàn)液制備方法的相應(yīng)改變。如何針對(duì)不同材質(zhì)不同工藝的醫(yī)療器械產(chǎn)品尋找出最佳的浸提方法，也是關(guān)系到整個(gè)評(píng)價(jià)試驗(yàn)是否成功且有意義的關(guān)鍵所在。

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The Application Status and Research Progress of the Genotoxicity Evaluation of Medical Devices

【W(wǎng)riters 】Zeng Dongming1,2, Hou Li1,2, Shi Yanping1,2
1 SFDA-Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices, Jinan 250101 2 Key Laboratory of biological evaluation of medical advices of Shandong Province,Jinan 250101

medical devices, genotoxicity, application status, research progress

【作者】田少雷國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心，北京市，100061

R318

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2012.05.014

1671-7104(2012)05-0362-03

2012-07-10

曾冬明，E-mail: dmzeng@163.com