劉 爍 潘 鋒 肖 文

(北京航空航天大學(xué) 儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院，北京 100191)

數(shù)字全息技術(shù)采用CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor)等數(shù)字相機(jī)記錄干涉圖譜，并通過數(shù)值再現(xiàn)來還原物光場(chǎng)分布，近年來其應(yīng)用領(lǐng)域已得到了廣泛拓展［1－3］.結(jié)合數(shù)字全息和光學(xué)顯微原理而發(fā)展出來的數(shù)字全息顯微術(shù)，已經(jīng)用于還原和分析MEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems)、生物細(xì)胞等微小物體的三維形態(tài)特征［4－6］.數(shù)字全息顯微術(shù)可同時(shí)獲得物光場(chǎng)的振幅和相位信息，且具有非接觸、非破壞、無標(biāo)記、高分辨率的優(yōu)勢(shì)，因而非常適用于生物樣品特別是活體組織和細(xì)胞的顯微觀察和定量分析，已成為數(shù)字全息應(yīng)用研究中的熱點(diǎn)［7－9］.

為了研究生命機(jī)理和分析某些特殊的生物效應(yīng)，活體細(xì)胞的培養(yǎng)和觀察多需在較復(fù)雜條件下完成，如在載人空間站的微重力環(huán)境下對(duì)生物細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)實(shí)驗(yàn).與原子力顯微術(shù)、共聚焦熒光顯微術(shù)等相比，數(shù)字全息顯微術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和樣品制備的要求相對(duì)較低，可在無損條件下進(jìn)行動(dòng)態(tài)定量分析.為更好地適應(yīng)生物活體細(xì)胞的觀測(cè)需求，本文搭建了一套預(yù)放大離軸數(shù)字全息顯微實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，利用單模光纖和光纖器件優(yōu)化了光路結(jié)構(gòu)，采用無窮遠(yuǎn)校正顯微物鏡提高了成像分辨率，并引入曲率匹配透鏡對(duì)相位畸變進(jìn)行了初步補(bǔ)償.在數(shù)值再現(xiàn)過程中，通過構(gòu)造數(shù)字掩模對(duì)相位畸變進(jìn)行了進(jìn)一步的校正.對(duì)在恒溫條件下培養(yǎng)的小鼠活體骨細(xì)胞樣品進(jìn)行了連續(xù)的動(dòng)態(tài)觀察，得到了細(xì)胞的高分辨率相襯圖像，觀測(cè)到了細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的形態(tài)變化，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和方法的有效性.

1 數(shù)字全息顯微原理

數(shù)字全息顯微術(shù)是在數(shù)字全息原理基礎(chǔ)上通過提升觀測(cè)分辨率實(shí)現(xiàn)的，主要實(shí)現(xiàn)方法包括合成孔徑法［6］、顯微物鏡預(yù)放大法［7］、無透鏡傅里葉變換法［9］等.其中顯微物鏡預(yù)放大法的分辨率提升效果最為直接.結(jié)合離軸全息記錄，此方法可利用單幅全息圖得到物光場(chǎng)的振幅和相位分布，因而更適用于動(dòng)態(tài)觀察.

數(shù)字全息顯微術(shù)的實(shí)現(xiàn)過程分為干涉記錄和數(shù)值再現(xiàn)兩步，其記錄光路有透射式和反射式兩種.生物活體細(xì)胞多為半透明狀態(tài)，其觀察一般采用透射式光路.圖1是本文采用的透射式預(yù)放大離軸數(shù)字全息顯微的記錄光路原理示意圖.一束照明光首先經(jīng)過待測(cè)樣品S透射，其強(qiáng)度變化反映了樣品的透射率分布，其光程變化則反映了樣品的形貌和折射率分布.透射光經(jīng)過無窮遠(yuǎn)校正顯微物鏡MO和中繼成像透鏡TL后完成預(yù)放大，形成物光O.物光O經(jīng)合光棱鏡BS與參考光R相干疊加，干涉圖譜被CMOS捕獲，形成數(shù)字全息圖.工作中，樣品S置于MO的前焦面處，可在TL的后焦面處形成樣品的放大實(shí)像I，此實(shí)像相當(dāng)于全息記錄的實(shí)際目標(biāo)物，觀測(cè)分辨率由此得以提升.為抑制全息中的零級(jí)像和共軛像干擾問題［10］，相干疊加時(shí)O和R在傳播方向上需要存在一個(gè)合適的夾角，構(gòu)成離軸數(shù)字全息記錄結(jié)構(gòu).

圖1 透射式預(yù)放大離軸數(shù)字全息顯微記錄原理

干涉記錄完成后，待測(cè)樣品的光學(xué)特征信息已經(jīng)包含在CMOS捕獲的數(shù)字全息圖中.在數(shù)值再現(xiàn)過程，通過對(duì)全息圖進(jìn)行數(shù)值處理和解算，可以得到物光場(chǎng)在放大實(shí)像平面的復(fù)振幅分布，進(jìn)而還原樣品的細(xì)節(jié)信息.

2 實(shí)驗(yàn)裝置搭建

傳統(tǒng)的數(shù)字全息顯微系統(tǒng)多通過分立光學(xué)元件直接搭建，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)比較松散，靈活性和穩(wěn)定性也較低.為適應(yīng)生物活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀測(cè)特點(diǎn)，通過引入單模光纖和光纖器件對(duì)數(shù)字全息顯微系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)如圖2所示.系統(tǒng)采用馬赫-曾德干涉儀結(jié)構(gòu)，利用倍頻Nd:YAG固體激光器(532nm，50mW)作為相干光源L，出射的激光經(jīng)光纖耦合器LFC進(jìn)入單模光纖OF，而后經(jīng)3 dB光纖分束器FS分為兩路.一路經(jīng)光纖準(zhǔn)直鏡FC出射作為照明光，經(jīng)待測(cè)樣品S透射后，利用無窮遠(yuǎn)校正顯微物鏡MO(20×，NA=0.4)和中繼成像透鏡TL完成預(yù)放大，形成物光O.另一路從光纖頭出射后形成球面光，經(jīng)曲率匹配透鏡CL調(diào)整后形成參考光R.O和R經(jīng)合光棱鏡BS實(shí)現(xiàn)相干疊加，形成數(shù)字全息圖，并被CMOS捕獲記錄.通過調(diào)節(jié)參考光路光纖出射端的角度，可以改變物光和參考光的夾角θ，保證離軸數(shù)字全息記錄的實(shí)現(xiàn).通過調(diào)整CL的位置，可以使R和O的曲率比較接近，對(duì)MO和TL導(dǎo)致的相位彎曲進(jìn)行初步補(bǔ)償.

圖2 生物活體細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)的數(shù)字全息顯微裝置

此系統(tǒng)利用單模光纖和光纖器件完成了照明光和參考光的傳導(dǎo)和分光，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊，質(zhì)量和體積較小，器件布局更為靈活，實(shí)驗(yàn)調(diào)整的難度也得以降低，從而適用于較復(fù)雜條件下活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)顯微觀察.

3 數(shù)值再現(xiàn)和相位還原

利用實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)獲取的數(shù)字全息圖，通過數(shù)值算法進(jìn)行解算，可再現(xiàn)還原物光場(chǎng)信息.數(shù)字全息圖H在CMOS記錄面獲取，可以表示為

其中，O和R分別表示物光和參考光在CMOS記錄平面的復(fù)振幅分布;*表示復(fù)共軛.在全息理論中，式(1)的最后一項(xiàng)對(duì)應(yīng)于虛像，物光場(chǎng)可通過此項(xiàng)還原.其他3項(xiàng)為干擾項(xiàng)，對(duì)應(yīng)于零級(jí)像和共軛像，根據(jù)離軸數(shù)字全息原理，這3項(xiàng)可以通過傅里葉頻域?yàn)V波濾除［11］.為校正離軸相位傾斜并進(jìn)一步補(bǔ)償顯微物鏡引入的相位彎曲［12］，構(gòu)造了數(shù)字相位掩模M，并將其與濾波后的全息圖相乘.進(jìn)而利用卷積再現(xiàn)算法［11］，得到放大實(shí)像所在平面的物光復(fù)振幅分布Ψ:

其中，DFT和DFT－1分別表示離散傅里葉變換和其逆變換;filter表示傅里葉頻域?yàn)V波;g表示空間脈沖響應(yīng)函數(shù).最后，由Ψ計(jì)算得到振幅圖A和相位圖φ:

其中，ΨRe和ΨIm分別表示Ψ的實(shí)部和虛部.振幅圖A和相位圖φ分別反映了樣品的透射率分布和樣品引入的光程變化.對(duì)于近似透明的活體細(xì)胞來說，振幅圖能夠反映的信息較少，而相位圖則可以用于分析細(xì)胞的形態(tài)和折射率分布，即相襯顯微圖.經(jīng)二維相位解包裹后，相位圖φ即可用于定量分析.

4 小鼠活體骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察和分析

為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和再現(xiàn)方法的有效性，對(duì)小鼠活體骨細(xì)胞樣品進(jìn)行了連續(xù)的動(dòng)態(tài)相襯顯微觀察.將預(yù)先培養(yǎng)的小鼠骨細(xì)胞MLO-Y4活體樣品接種在35mm培養(yǎng)皿中，利用圖2所示的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察.為保證活體細(xì)胞樣品在37℃的恒溫環(huán)境下生長(zhǎng)，物光光路周圍配備了一個(gè)半封閉的圓柱形熱水循環(huán)設(shè)備，培養(yǎng)皿、光纖準(zhǔn)直鏡和顯微物鏡都放置于此設(shè)備中心的空腔里.實(shí)驗(yàn)中所用CMOS相機(jī)的分辨率為1024×1024，像素大小為6.7μm ×6.7μm，拍攝獲取全息圖的曝光時(shí)間約為10ms.采用定時(shí)拍攝功能，每隔1min獲取一幅數(shù)字全息圖，連續(xù)觀察了8 h，共得到480幅全息圖.利用之前所述的數(shù)值再現(xiàn)方法進(jìn)行解算，即可得到反映活體細(xì)胞生長(zhǎng)變化的顯微圖像.圖3a是獲取的第一幅數(shù)字全息圖，圖3b和圖3c分別為利用此幅全息圖再現(xiàn)得到的振幅圖和相位圖.由于活體細(xì)胞近似透明且沒有經(jīng)過染色處理，振幅圖中細(xì)胞的輪廓和形態(tài)特征并不明顯，而相位圖則較為清晰地反映了細(xì)胞引入的光程變化和形貌特征.視場(chǎng)中存在很多細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞都可以進(jìn)行獨(dú)立的動(dòng)態(tài)分析.圖4中顯示了圖3c虛線框內(nèi)的細(xì)胞在觀察開始后0，40和80min 3個(gè)不同時(shí)刻的相襯顯微圖.從圖中可以看出，隨著時(shí)間的推移，此細(xì)胞發(fā)生了明顯的運(yùn)動(dòng)和形態(tài)變化.實(shí)驗(yàn)中利用20×顯微物鏡進(jìn)行預(yù)放大，成像分辨率達(dá)到了微米量級(jí).

圖3 小鼠活體骨細(xì)胞樣品的數(shù)字全息顯微觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 小鼠活體骨細(xì)胞樣品在不同時(shí)刻的相襯顯微圖像

5 結(jié)論

數(shù)字全息顯微術(shù)提供了一種無損、無標(biāo)記的高分辨率定量相襯顯微方法.利用單模光纖和光纖器件可以優(yōu)化數(shù)字全息顯微裝置的光路結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)緊湊性和靈活性.采用曲率匹配透鏡和數(shù)字相位掩模相結(jié)合的方法，可以對(duì)相位畸變進(jìn)行有效校正.小鼠活體骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，數(shù)字全息顯微術(shù)可以動(dòng)態(tài)獲得高分辨率的活體細(xì)胞相襯顯微圖像，從而用于分析細(xì)胞的生長(zhǎng)變化和運(yùn)動(dòng)過程.通過對(duì)實(shí)驗(yàn)裝置和再現(xiàn)算法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，數(shù)字全息顯微術(shù)將可以更為廣泛地應(yīng)用于生物活體組織和細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察，從而促進(jìn)對(duì)生物過程的理解，推動(dòng)生命科學(xué)研究的發(fā)展.

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