奉水旺， 楊 麗， 王攀攀， 李淑琴， 汪 甜， 尹素娟， 張榮華△

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632)

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，通過遷移、增殖、分化，在骨吸收部位形成成骨細胞(osteoblast，OB)，并介導(dǎo)新骨組織形成的過程，也是骨形成的核心過程［1］。目前對MSCs的成骨分化和骨形成的分子機制認識有限，給骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松(osteoprosis，OP)的治療帶來局限。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)信號在MSCs成骨分化中發(fā)揮了重要作用［2］。實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素(quercetin，QUE)可以抑制去勢小鼠骨量丟失而對子宮沒有不利影響，但其作用機制還不明確［3］。本實驗通過研究QUE是否能促進MSCs成骨，并探索ERK信號通路是否在此過程中發(fā)揮重要作用，以期闡明QUE保護骨量的細胞分子生物學(xué)機制，為QUE應(yīng)用于OP等骨代謝疾病的預(yù)防和治療提供細胞分子生物學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級3月齡雌性Sprague－Dawley (SD)大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK粵2006－0015。MSCs由大鼠股骨和脛骨中分離提取，傳至第3代后進行實驗。

1.2 主要試劑 Alpha－modified minimum essential medium(α－MEM)購于HyClone;優(yōu)級胎牛血清購于天津灝洋生物制品科技有限責任公司;QUE購于中國藥品生物制品檢定所;PD98059購于Millipore;噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物科技公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所;酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于RB公司;甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗大鼠Ⅰ抗、ERK1/2和p－ERK1/2兔抗大鼠Ⅰ抗及羊抗兔Ⅱ抗購于Cell Signaling;SYBR Green PCR Master Mix購于Toyobo。

2 方法

2.1 MSCs的提取 大鼠頸椎脫臼處死，75% 乙醇浸泡10 min;分離雙側(cè)下肢，取出股骨和脛骨，去盡表面肌肉以及骨膜;將取出的股骨和脛骨移至超凈工作臺，用75% 乙醇泡10～30 s，D－Hanks液沖洗5～8次;剪去骨兩干骺端，用5 mL注射器吸取含10%FBS的α－MEM完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔;用1 mL注射器4×13 TW LB針頭反復(fù)吹打，使細胞成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1.0×109cells/L，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后半量換液，48 h后全量換液，以后每隔3 d換1次培養(yǎng)液。3代以后的細胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測QUE對MSCs的增殖作用 細胞傳到第3代用0.25% 胰蛋白酶消化、重懸，以5.0× 106cells/L密度接種于96孔板中。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)到細胞達80% 融合時，設(shè)置含QUE 0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的給藥濃度組以及空白組，每組6個復(fù)孔。加入無血清的MEM/α培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，分別加入上述藥物濃度的MEM/α完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄MTT溶液，加100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，酶標儀490 nm波長檢測吸光度(A)。

2.3 ALP測定試劑盒檢測不同濃度QUE對MSCs的ALP活性的影響 以1.0×108cells/L細胞密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)到細胞達80% 融合時，按上述實驗分組設(shè)置，每組6個孔。加入無血清的α－MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，分別加入上述藥物濃度的α－MEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后，吸棄孔中的培養(yǎng)液，用D－Hanks液洗2～3遍，每孔加入細胞裂解液1 mL，4℃作用30 min，收集細胞裂解液。BCA法檢測各組的總蛋白濃度，用ALP檢測試劑盒檢測各組ALP表達。

2.4 分組及干預(yù)方法 將細胞以1.0×108cells/L的細胞密度接種于6個60 mm培養(yǎng)皿中，將其設(shè)置為空白對照組、QUE組、QUE+PD98059組和PD98059組。細胞無血清α－MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，需加抑制劑的組先加入抑制劑30 min后，再加入QUE，使各抑制劑最終濃度PD98059為10 μmol/L，QUE的最終濃度為10 μmol/L。

2.5 檢測各組ALP、Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，ColⅠ)和骨鈣素(bone Gla protein，BGP)表達 按2.4方法操作后共同培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)液，用 DHanks液洗滌3次，加入150 μL細胞裂解液，收集細胞裂解液。用BCA法測定各組的總蛋白濃度，用ALP檢測試劑盒檢測各組ALP表達，ELISA法檢測各組ColⅠ和BGP表達。

2.6 Western botting檢測ERK1/2及其磷酸化蛋白的表達 按2.4方法操作后共同培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用D－Hanks液洗滌3次，加入100 μL細胞裂解液，收集細胞裂解液。用BCA法檢測各組總蛋白濃度，12%SDS－PAGE凝膠進行電泳分離，每組上樣總蛋白量30 μg，轉(zhuǎn)膜，封閉，加Ⅰ抗、辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗，用ECL液進行熒光顯影并顯示在X光片上，結(jié)果用Quantity One Manual圖像分析軟件測定各條帶的灰度并進行分析。

2.7 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)、骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)和核心結(jié)合因子α1 (core binding factor α1，Cbfα1)mRNA的表達 設(shè)計18S、TGF－β1、BMP－2和Cbfα1的熒光定量PCR引物(序列見表1)。按2.4方法分組后共同培養(yǎng)24 h，Trizol提取總RNA，取1 μg總RNA合成cDNA，然后以cDNA為模板，進行上述各基因的熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL;cDNA 5 μL;上、下游引物各0.5 μL; dH2O 4 μL。反應(yīng)在 ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System上進行，運行條件為:先95℃ 5 min，然后95℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 32 s，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)的第2步結(jié)束后收集熒光信號，以熒光信號對反應(yīng)循環(huán)數(shù)作圖。每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔，取平均值Ct，通過ΔΔCt法計算各組細胞的上述基因的表達水平。

表1 熒光定量PCR的引物序列Table 1 .The primer sequences for fluorescence quantitative PCR

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 QUE對MSCs的增殖和ALP表達的影響

MTT結(jié)果顯示，10 μmol/L組、1 μmol/L組和0.1 μmol/L組A值顯著高于空白組(P＜0.05)，但10 μmol/L組、1 μmol/L組和0.1 μmol/L組之間A值無顯著差異(P＞0.05);ALP表達結(jié)果顯示，10 μmol/L組ALP表達顯著高于其它各組(P＜0.05)。因此，10 μmol/L QUE具有最佳促MSCs骨向分化的作用，見表2。

表2 不同QUE濃度對MSCs的增殖和ALP表達的影響Table 2 .Effects of different concentrations of QUE on the proliferation and ALP expression of MSCs(±s.n=6)

表2 不同QUE濃度對MSCs的增殖和ALP表達的影響Table 2 .Effects of different concentrations of QUE on the proliferation and ALP expression of MSCs(±s.n=6)

*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

?

2 對MSCs干預(yù)后ALP、BGP和ColⅠ表達的結(jié)果

QUE組ALP、BGP和ColⅠ表達高于空白組(P＜0.01)，QUE+PD98059組ALP、BGP和ColⅠ表達低于QUE組(P＜0.01)，QUE+PD98059組ALP、BGP和ColⅠ表達高于PD98059組(P＜0.01)，見表3。

表3 實驗各組ALP、ColⅠ和BGP表達Table 3 .Effects of ERK signaling on ALP，BGP and ColⅠexpression in MSCs(±s.n=3)

表3 實驗各組ALP、ColⅠ和BGP表達Table 3 .Effects of ERK signaling on ALP，BGP and ColⅠexpression in MSCs(±s.n=3)

＊＊P＜0.01 vs control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs QUE group.

?

3 磷酸化ERK1/2表達的檢測結(jié)果

與空白組比較，QUE組磷酸化ERK1/2表達增加(P＜0.05);與QUE組比較，QUE+PD98059組和PD98059組磷酸化ERK1/2表達減少(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Phosphorylation of ERK1/2 in QUE－treated MSCs analyzed by Western blotting.圖1 Western blotting檢測磷酸化ERK1/2的表達

4 TGF－β1、BMP－2和Cbfα1 mRNA表達的檢測結(jié)果

與空白組比較，QUE組BMP－2和Cbfα1的表達均增加(P＜0.01)，TGF－β1表達也增加(P＜0.05);與QUE組比，QUE+PD98059組和PD98059組BMP－2和Cbfα1的表達下降(P＜0.01)，TGF－β1表達也下降(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of TGF－β1，BMP－2 and Cbfα1 mRNA in QUE or/and PD98059－treated MSCs.±s.n =3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs QUE group.圖2 TGF－β1、BMP－2和Cbfα1 mRNA的表達

討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSCs成骨分化能力減弱而成脂分化能力增強是OP發(fā)生的重要機制之一［3］，因此對MSCs成骨分化能力調(diào)節(jié)的研究成為OP治療機制研究的熱點。現(xiàn)有研究表明，QUE可以抑制去勢小鼠骨量丟失而對子宮沒有不利影響，但其作用機制的研究還不明確，尤其在它對MSCs是否有作用，如何作用方面還沒有報道［4］。因此，本實驗從QUE是否能促進MSCs成骨分化入手，并深入探索ERK信號通路是否在此過程發(fā)揮作用。

MSCs在成骨分化過程中的不同階段會表達各種骨特征標志蛋白，如ALP和ColⅠ在成骨分化早期表達高，發(fā)生礦化后有所降低，隨后是基質(zhì)蛋白，如:骨橋蛋白和骨涎蛋白，最后同時出現(xiàn)BGP和細胞外基質(zhì)鈣化。這些基質(zhì)蛋白的協(xié)同作用，保證了細胞外基質(zhì)的成熟，伴隨著外基質(zhì)的成熟，OB被包埋其中而形成骨組織［5］。因此，本實驗通過檢測ALP成骨特異性指標，來評價不同濃度QUE促進MSCs骨向分化能力;同時以ERK1/2的磷酸化對ALP、ColⅠ和BGP蛋白的影響，來評價ERK信號通路在QUE促進MSCs成骨分化過程可能起到的作用。本實驗對不同濃度QUE進行篩選，實驗結(jié)果提示，10 μmol/ L QUE具有最佳促MSCs骨向分化作用，并能促進MSCs的增殖。

ERK通路是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)系統(tǒng)中主要的通路。MAPK具有顯著的進化保守三級激酶級聯(lián)形式的特點:細胞受刺激后激活MAPK激酶的激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)，進而激活MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)，MKK激活后通過雙位點磷酸化調(diào)控MAPK的活性。ERK通路是MAPK系統(tǒng)主要和經(jīng)典的通路:細胞外信號→細胞受體→細胞內(nèi)酪氨酸激酶和適配蛋白→Ras→Raf→MEKK1→MEK1→ERK1/2→轉(zhuǎn)錄因子→細胞增殖、轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達→細胞增生、轉(zhuǎn)化。許多研究證明［6－7］，ERK在MSCs成骨分化中起到重要的調(diào)節(jié)作用。BMPs是屬于TGF－β超家族的成員之一，因其能促進OB、成軟骨細胞的分化和誘導(dǎo)異位骨形成而得名。研究表明BMP－2和TGF－β1在MSCs成骨分化中能起到十分重要的作用［8－9］。Cbfα1是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子又稱Runx2［10］。Shi等［11］通過實驗證明，間歇性拉伸載荷刺激 MSCs骨向分化是通過RhoA－ERK1/2通路調(diào)制Cbfα1變化起作用的，因此Cbfα1作為ERK通路促進MSCs成骨分化的下游轉(zhuǎn)錄因子，可作為判斷ERK通路是否激活的重要指標。我們在實驗中加入QUE，磷酸化的ERK1/2增加，同時Cbfα1表達增加;PD98059抑制ERK1/2后加入QUE，磷酸化的ERK1/2減少，同時Cbfα1表達減少;結(jié)果表明，QUE能激活ERK通路。實驗中在加入或不加入 ERK1/2的抑制 PD98059情況下，BMP－2和TGF－β1表達隨之改變，說明BMP－2和TGF－β1與ERK通路有重要的聯(lián)系，那么它們之間有著怎么樣的聯(lián)系呢?

有研究表明［12］，在大豆黃酮促進成人干細胞增殖實驗中發(fā)現(xiàn)ERK依賴TGF－β1的調(diào)節(jié);然而也有報道用藥物阻斷Ras/MEK/ERK后［13］，TGF－β1表達同時受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，QUE在誘導(dǎo)MSCs成骨的過程中，成骨分化相關(guān)指標表達增加，同時伴隨BMP－2和TGF－β1表達增加;用PD98059抑制ERK1/2后，成骨分化相關(guān)指標表達下降，同時BMP－2和TGF－β1表達也降低;有許多研究已經(jīng)證明ERK通路能介導(dǎo) Cbfα1的表達［14］，TGF－β/BMPs通路也能調(diào)節(jié)Cbfα1［15］。因此，QUE在促進MSCs成骨過程中，激活了ERK通路，激活的ERK通路對TGF－β1和BMP－2有調(diào)節(jié)作用，在ERK通路與TGF－β/BMPs通路之間的交互作用下，共同調(diào)節(jié)成骨轉(zhuǎn)錄因子Cbfα1，從而調(diào)節(jié)成骨分化;從ERK通路的激活到促進BMP－2和TGF－β1的生成從而增強對Cbfα1調(diào)節(jié)作用，這一過程將QUE促進MSCs成骨的作用放大。

綜上所述，一定濃度的QUE能促進MSCs的增殖和成骨分化，ERK信號的激活在QUE促進MSCs成骨過程中起到十分重要的作用。

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